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potata

金虫 (正式写手)

[交流] 酶切 酶连 载体构建 part7 part27 已有3人参与

最近在用part7 part27构建载体,用习惯LR反应的人再用酶切、酶连构建载体,真是麻烦!
快酶、慢酶都用了,takara, fermantas ,NEB的酶都用了;
各有优缺点,最后比较起来takara的慢酶相对还是不错;
再说连接,片段比较大,连接T载体的时候就很难连,现在连接part7 和27也很难,不停地大量做菌液PCR筛选,累死;
现在还在工作中。
来这里,想和有同样经历的虫友分享一下,不知道有没有感兴趣的?
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cultivationeducation
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kinshi

铜虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
平末端加peg试试,目的片段摩尔浓度是载体大概5倍,大片段本来就不是很好连更何况还是平端

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
6楼2013-12-22 23:02:33
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woshishui916

木虫 (著名写手)

能再具体说说看不?
2楼2013-12-22 19:06:58
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potata

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by woshishui916 at 2013-12-22 19:06:58
能再具体说说看不?

期望酶切后,回收片段,再连接,可是总是切不出理想的条带;而连接的时候,因为是平末端,且连接片段都很大,2k,到4k多,连接也比较困难!
不知道,有什么好方法或建议?
cultivationeducation
3楼2013-12-22 22:26:43
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woshishui916

木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by potata at 2013-12-22 22:26:43
期望酶切后,回收片段,再连接,可是总是切不出理想的条带;而连接的时候,因为是平末端,且连接片段都很大,2k,到4k多,连接也比较困难!
不知道,有什么好方法或建议?...

试试无缝克隆吧
4楼2013-12-22 22:46:10
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