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lm334723460

银虫 (小有名气)

[交流] PCR引物 已有5人参与

我从文献上找了一对引物，现在要试扩增的程序，退火温度等。我想问下各位是怎么做的。
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1楼 2013-12-18 22:05:08
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小肥肉007

新虫 (小有名气)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-12-19 09:18:12
梯度PCR

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-12-18 22:46:45
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三蛰

铜虫 (小有名气)
同意楼上，梯度
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我不会！
3楼2013-12-19 09:49:22
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lm334723460

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-19 09:49:22
同意楼上，梯度

能具体说一下吗
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4楼2013-12-19 09:51:53
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achonghello

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 20:51:45
可以用NCBI里面的BLAST验证一下引物，看一下大概的温度是多少，以及产物。。。。。
再用梯度PCR。。。
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5楼2013-12-19 15:39:37
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小肥肉007

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by lm334723460 at 2013-12-19 09:51:53
能具体说一下吗

我们实验室的PCR仪是可以做梯度的，退火温度可以设置12个不同的梯度
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6楼2013-12-19 19:37:02
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Dr.G

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 20:51:58
你要“退火温度等”，你是要摸索PCR的最佳实验条件吗？
如果是的话：
1.引物Tm值你知道了吧，你使用的taq酶说明书上有建议的退火温度（不同厂家Taq酶的扩增能力、扩增速度、与模板的亲和能力各有不同，所以同一模板不同厂家的酶PCR的退火温度、延伸时间会有差异），你浏览下所使用的Taq酶说明书建议的退火温度（扩增能力强的Taq酶退火温度为Tm值低1-2度，扩增能力差点的为Tm值低5度  等等）
2.TOUCHDOWN摸索退火温度
3.预变性的温度、时间；变性的温度、时间；延伸的温度、时间；这些Taq酶说明书上会有说明，不同牌子的酶会有差异
4.顺便说一句：没有一成不变的退火温度或者延伸时间等等，PCR的条件不仅和引物、模板关系很大，而且与所使用的Taq酶的特点也有很大关系，而很多同学会忽略了所使用的Taq酶的特点
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7楼2013-12-19 20:02:36
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lm334723460

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Dr.G at 2013-12-19 20:02:36
你要“退火温度等”，你是要摸索PCR的最佳实验条件吗？
如果是的话：
1.引物Tm值你知道了吧，你使用的taq酶说明书上有建议的退火温度（不同厂家Taq酶的扩增能力、扩增速度、与模板的亲和能力各有不同，所以同一模 ...

谢谢指导
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8楼2013-12-19 20:55:22
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2008101111

金虫 (正式写手)

学术江湖混子
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
计算TM值，拉个退火温度就可以的
赞一下 回复此楼
自主创业者，捣腾生物试剂
9楼2013-12-22 13:22:30
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