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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：关于rTaq和LA Taq酶的
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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zhucj82

铁杆木虫 (小有名气)

[交流] 求助：关于rTaq和LA Taq酶的

我要扩增3400bp的目的基因用于克隆，用的rTaq一次都没扩增出来过，想换LAtaq，可不知LA Taq使用时Mg、dNTP、酶、buffer的用量，还有程序是否与rTaq一样：
94度，5min
94度，1min
65度，1min
72度，4min
30cycles
72度，15min
请高手们帮帮忙，感激不尽！实在是做的太郁闷了！
奖励金币10个！
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1楼 2007-12-30 12:19:30
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dearmarie

铁虫 (初入文坛)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):欢迎交流
3400bp确实应该用LATaq，rTaq扩两千以下的，多了就不行了。关于反应体系，参考说明书的推荐体系，有两种buffer，买的时候问清楚，普通的buffer以及GC buffer，根据你的GC含量而定。你的反应条件中退火温度似乎较高，是因为引物的Tm值就设计的很高吗，可以降低些，或做个梯度试试，延伸时间按15~30s/kb即可。
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3楼2007-12-30 20:57:52
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Airare

金虫 (正式写手)

虫游天下
★ ★
谷峰(金币+2,VIP+0):谢谢！！！！
用普通Taq既然一次都扩增不出来，程序本来就不好了吧。酶的保真性还是很重要的，特别是你要的基因又比较大，所以就应该用高保真酶。以前做扩不出来，换了酶，原程序也可做的出来，不过你的原程序嘛～
LA Taq 还是不错的选择，条件还得摸一下。顺便说一下，做的好的话，循环数20－25就行了，以免突变，得不偿失～
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——穿越死亡之门，到我这里来，虽则梦想褪色，岁月集成的果实腐烂掉，但我是永恒的真理，你将再会见我，在你从此岸渡向彼岸的生命航程中...
2楼2007-12-30 12:41:57
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freshair33

谢谢帮助
我两条引物的Tm值分别是63和65度，我实际做用过55，57，59度，都没扩出来。
楼上的是说LA Taq的延伸速度是15~30s/kb吗？跟rTaq相差挺远的啊
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4楼2007-12-31 12:28:48
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dearmarie

铁虫 (初入文坛)
★
johnsooh(金币+1,VIP+0):thx
我说的是用LA Taq时延伸时间的设定依据扩增子长度来计算。
你这样的引物Tm值，当然应该往低的温度试，65显然不行，还有，你是用rTaq试的，那不成功很正常。改用LA再试试，降低退火温度，三千多不算难扩的。
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5楼2007-12-31 20:36:54
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