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[求助]DNA、RNA等含量检测
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zhenyanweixiao
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3楼2008-01-08 08:32:00
zhenyanweixiao
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一、光密度测定法 [原理] DNA和RNA在260nm处有一很高的吸收峰，利用这个原理我们测其OD260，再推算出其浓度。 [仪器] 分光光度计(紫外可见光两用)。 [试剂] 水，DNA或RNA溶液。 [操作] (1)取5ulDNA样品或4ulRNA样品加水到lml。 (2)用lml水做空白。 (3)把样品杯放在分光光度计比色槽上。 (4)每ul中DNA或RNA浓度(ug)将是OD值的10倍，例如稀释后样品在260nm处OD值为0.2，则原DNA或RNA样品浓度为2ug／ul。 (5)如果想要检测样品的纯度，那么还要再测一次280nm处OD值，计算二者的比率，若比率接近2，则说明样品中核酸比较纯。若比率小于1.6，则说明蛋白或其它吸收此波长的杂质在其中，建议再用酚／氯仿抽提继以乙醇沉淀以除去杂质。 (6)如果想检测样品中是否残存酚等有机杂质，那么还要测定一次230nm处OD值。 二、琼脂糖电泳测量法 [原理] 质粒DNA及微量DNA片段的浓度可与已知浓度的DNA同时进行电泳，根据结合的溴化乙锭荧光强度，估计其含量。 [仪器] 紫外透射反射分析仪(上海康华生化仪器制造厂)；电泳槽；电泳梳；电泳仪。 [试剂] 6×上样缓冲液：0.25％溴酚蓝；40％(W／V)糖。 10×TBE电泳缓冲液：0.89mol/LTris-硼酸；0.02mol／LEDTANa2pH8.3。 0.8％琼脂糖：0.8％琼脂糖；100mi 1×TBE 5mg／mlEB：0.5gEB；100ml三蒸水 [操作] (1)用1×TBE电泳缓冲液0.8％琼脂糖凝胶，加溴化乙锭其终浓度为0.5ug／m1。 (2)加热使琼脂糖熔化均匀，取出室温冷却至50-60℃。 (3)取一块5×7cm玻璃板，置水平台上，放一微型点样梳，点样梳底部离玻璃平板的距离为0.5-1. 0mm。 (4)将凝胶小心倒在玻璃板上，待冷却后取出点样梳，保持点样孔的完好。 (5)取DNA样品及),DNA标准浓度各lul加入1×TBE4ul，加入6×上样缓冲液lul，混 匀。 (6)在0.8％琼脂糖凝胶点样孔小心点样，记录样品点样次数与点样量。 (7)打开电源开关，电压不超过5V／cm，一般40V，30-40分钟。 (8)取出泳动后的凝胶板，翻转玻璃盖在紫外分析仪观察DNA区带。 (9)DNA含量的估计：比较待测DNA的条带与已知DNA的各条带的荧光密度，估计待测DNA在凝胶中的含量，再估计出其浓度。 |
2楼2008-01-08 08:09:39
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