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冰眉儿

木虫 (著名写手)

[求助] [求助]DNA、RNA等含量检测

请教:霉菌DNA、RNA、脂肪酸、氨基酸含量测定的方法。希望能够提供具体的试验步骤或参考文献。谢谢!

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zhenyanweixiao

金虫 (正式写手)

一、光密度测定法
  [原理]

  DNA和RNA在260nm处有一很高的吸收峰,利用这个原理我们测其OD260,再推算出其浓度。

    [仪器]

    分光光度计(紫外可见光两用)。

    [试剂]

    水,DNA或RNA溶液。

    [操作]

    (1)取5ulDNA样品或4ulRNA样品加水到lml。

    (2)用lml水做空白。

    (3)把样品杯放在分光光度计比色槽上。

    (4)每ul中DNA或RNA浓度(ug)将是OD值的10倍,例如稀释后样品在260nm处OD值为0.2,则原DNA或RNA样品浓度为2ug/ul。

    (5)如果想要检测样品的纯度,那么还要再测一次280nm处OD值,计算二者的比率,若比率接近2,则说明样品中核酸比较纯。若比率小于1.6,则说明蛋白或其它吸收此波长的杂质在其中,建议再用酚/氯仿抽提继以乙醇沉淀以除去杂质。

    (6)如果想检测样品中是否残存酚等有机杂质,那么还要测定一次230nm处OD值。

    二、琼脂糖电泳测量法

    [原理]

    质粒DNA及微量DNA片段的浓度可与已知浓度的DNA同时进行电泳,根据结合的溴化乙锭荧光强度,估计其含量。

    [仪器]

    紫外透射反射分析仪(上海康华生化仪器制造厂);电泳槽;电泳梳;电泳仪。

    [试剂]

    6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝;40%(W/V)糖。

    10×TBE电泳缓冲液:0.89mol/LTris-硼酸;0.02mol/LEDTANa2pH8.3。

    0.8%琼脂糖:0.8%琼脂糖;100mi 1×TBE

    5mg/mlEB:0.5gEB;100ml三蒸水

    [操作]

    (1)用1×TBE电泳缓冲液0.8%琼脂糖凝胶,加溴化乙锭其终浓度为0.5ug/m1。

    (2)加热使琼脂糖熔化均匀,取出室温冷却至50-60℃。

    (3)取一块5×7cm玻璃板,置水平台上,放一微型点样梳,点样梳底部离玻璃平板的距离为0.5-1. 0mm。

    (4)将凝胶小心倒在玻璃板上,待冷却后取出点样梳,保持点样孔的完好。

    (5)取DNA样品及),DNA标准浓度各lul加入1×TBE4ul,加入6×上样缓冲液lul,混

  匀。

    (6)在0.8%琼脂糖凝胶点样孔小心点样,记录样品点样次数与点样量。

    (7)打开电源开关,电压不超过5V/cm,一般40V,30-40分钟。   

    (8)取出泳动后的凝胶板,翻转玻璃盖在紫外分析仪观察DNA区带。

    (9)DNA含量的估计:比较待测DNA的条带与已知DNA的各条带的荧光密度,估计待测DNA在凝胶中的含量,再估计出其浓度。
2楼2008-01-08 08:09:39
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zhenyanweixiao

金虫 (正式写手)

3楼2008-01-08 08:32:00
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