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hahayou36532铁虫 (小有名气)
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[求助]
从乳酸菌筛选以及基因克隆阿魏酸酯酶
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大神们，我有一个问题，如何用基因工程的方法从乳酸杆菌中克隆出阿魏酸酯酶？大概从下面四个步骤来做， 1、确定目的基因（包括乳酸菌菌种） 2、选择载体 3、确定受体细胞转化培养条件 4、筛选阳性菌落 可否说下四步你的具体如何展开，试剂的用量这些细枝末节没必要说明，主要求一下思路。。。 另外确定目的基因除了试剂盒法还有什么好方法吗？ |
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hahayou36532
铁虫 (小有名气)
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3楼2013-12-11 12:58:53
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-12 15:37:35
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-12 15:37:35
非专业建议 1.利用生物信息学手段查找乳酸杆菌基因组，数据库中应该会有阿魏酸酯酶的编码基因，以及会注释该基因组是哪种乳酸杆菌的，酶切下来即可，要是无法酶切就全合成吧，合成一个碱基貌似1块大洋的样子，然后pcr 2.利用带有抗性的质粒进行克隆，可以将其转入大肠杆菌（是感受态的哦，亲）中去，先选抗性质粒，酶切后将目的基因连接上，我们实验室常用大肠感受态，先逐步升温解冻复活，然后冷激再热激等等 3.让后平板划线，挑单菌落，摇瓶放大一批，提质粒，测序确定得到的大肠是含有目的片段的，若测序结果是对的，那么你就可以再进一步扩大，同时要留一些做菌种进行保存。 不知对不对，我也还没做实验，全凭主观臆断的  |
2楼2013-12-11 10:57:26
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ok |
4楼2013-12-11 13:35:29
hahayou36532
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5楼2013-12-11 23:18:14
