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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 从乳酸菌筛选以及基因克隆阿魏酸酯酶
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hahayou36532

铁虫 (小有名气)

[求助] 从乳酸菌筛选以及基因克隆阿魏酸酯酶

大神们，我有一个问题，如何用基因工程的方法从乳酸杆菌中克隆出阿魏酸酯酶？大概从下面四个步骤来做，
1、确定目的基因（包括乳酸菌菌种）
2、选择载体
3、确定受体细胞转化培养条件
4、筛选阳性菌落
可否说下四步你的具体如何展开，试剂的用量这些细枝末节没必要说明，主要求一下思路。。。

另外确定目的基因除了试剂盒法还有什么好方法吗？
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开心就好
1楼 2013-12-10 22:53:39
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屿iland

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-12 15:37:35
非专业建议
1.利用生物信息学手段查找乳酸杆菌基因组，数据库中应该会有阿魏酸酯酶的编码基因，以及会注释该基因组是哪种乳酸杆菌的，酶切下来即可，要是无法酶切就全合成吧，合成一个碱基貌似1块大洋的样子，然后pcr
2.利用带有抗性的质粒进行克隆，可以将其转入大肠杆菌（是感受态的哦，亲）中去，先选抗性质粒，酶切后将目的基因连接上，我们实验室常用大肠感受态，先逐步升温解冻复活，然后冷激再热激等等
3.让后平板划线，挑单菌落，摇瓶放大一批，提质粒，测序确定得到的大肠是含有目的片段的，若测序结果是对的，那么你就可以再进一步扩大，同时要留一些做菌种进行保存。

不知对不对，我也还没做实验，全凭主观臆断的
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2楼2013-12-11 10:57:26
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hahayou36532

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 屿iland at 2013-12-11 10:57:26
非专业建议
1.利用生物信息学手段查找乳酸杆菌基因组，数据库中应该会有阿魏酸酯酶的编码基因，以及会注释该基因组是哪种乳酸杆菌的，酶切下来即可，要是无法酶切就全合成吧，合成一个碱基貌似1块大洋的样 ...

谢谢大神。有不懂得再问你可以吗？

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开心就好
3楼2013-12-11 12:58:53
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屿iland

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hahayou36532 at 2013-12-11 12:58:53
谢谢大神。有不懂得再问你可以吗？
...

ok
4楼2013-12-11 13:35:29
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hahayou36532

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 屿iland at 2013-12-11 13:35:29
ok...

大神，我在NCBI中的gene类下输入ferulicacidesterase（阿魏酸酯酶），然后怎么找基因序列呢？还有设计引物呢。。。
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开心就好
5楼2013-12-11 23:18:14
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屿iland

金虫 (小有名气)
内容已删除
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6楼2013-12-13 14:28:11
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hahayou36532

铁虫 (小有名气)
大神，我是在NCBI中选nucleotide,输入ferulic acid esterase，出来的第一条结果中我按你的方法选基因序列，
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/298264511?from=1374&to=2174&sat=4&sat_key=42523425&report=gbwithparts
这样你看可以吗？
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7楼2013-12-14 09:42:57
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hahayou36532

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 屿iland at 2013-12-13 14:28:11
我试着从protein数据库找了一下，你的阿魏酸酯酶的英语是错的，应该是feruloyl esterase，后面再叫上乳酸杆菌的英语名（单数形式）lactobacillus然后搜就是了，我发现出来的数据第一个没有测得基因序列，换了第二个 ...

序列找出来差不多，但是引物设计按你给的链接出现问题了，引物设计我出来的的怎么有五条。。。不是应该只有一条引物的吗？还有organism我选哪一个？Lactobacillus buchneri (taxid:1581)         Lactobacillus buchneri ATCC 11577 (taxid:525318)         Lactobacillus buchneri NRRL B-30929 (taxid:511437)     Lactobacillus buchneri CD034 (taxid:1071400)上面这四种，，，怎么选。。。
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8楼2013-12-14 11:21:34
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屿iland

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hahayou36532 at 2013-12-14 11:21:34
序列找出来差不多，但是引物设计按你给的链接出现问题了，引物设计我出来的的怎么有五条。。。不是应该只有一条引物的吗？还有organism我选哪一个？Lactobacillus buchneri (taxid:1581)         Lactobacillus bu ...

这个我一般都是直接选genbank旁的pick primer，就直接系统就给你选好了，但是你的这个当我用这种方法时，就行不通，后来换了个nr数据库就可以了，但不知道引物可用不可用

要不你直接下个软件自己设计吧！
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9楼2013-12-15 12:27:48
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hahayou36532

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 屿iland at 2013-12-15 12:27:48
这个我一般都是直接选genbank旁的pick primer，就直接系统就给你选好了，但是你的这个当我用这种方法时，就行不通，后来换了个nr数据库就可以了，但不知道引物可用不可用

要不你直接下个软件自己设计吧！...

嗯嗯，我用primer6.试了下，谢谢你拉

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10楼2013-12-15 13:15:15
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