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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于双酶切
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张爽00100

金虫 (小有名气)

[求助] 关于双酶切 已有1人参与

最近在做两个双酶切，NcoI和BamH I;BamH I和XhoI ;都是MBI的，双酶切的buffer分别是1*tango和2*tango，和酶一起的都是10*buffer tango，要稀释吗？还有双酶切的体系一般是怎样的，之前师姐实验做的都是50ul：酶各1ul、DNA 10ul、10*buffer 5ul 、ddH2O 33ul。但是做两次都没有做出来，希望各路大侠赐教。
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1楼 2013-12-10 21:46:58
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ww贝尼

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-11 09:59:12
我做过质粒的双酶切
做验证的话 10ul的体系  酶各0.5  质粒2.5  buffer分别为1ul、2ul  剩下用ddH2O补足10ul
胶回收 50ul的体系就可以，酶各2.5  质粒25   buffer分别为5ul、10ul 剩下 用ddH2O补足50ul
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2楼2013-12-11 08:41:41
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zct2008

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-12-11 09:59:17
首先你的反应体系应该是对的，没有什么问题。建议你看一下这两个双酶切：NcoI和BamH I;BamH I和XhoI，每一种酶各自的buffer是什么，双酶切时是否通用。例如BamH I和XhoI 这两个酶Takara公司的分别是buffer K和buffer H，双酶切时Takara公司建议使用1*buffer K。由于我没有用过MBI的限制性内切酶，不清楚MBI公司针对这几种酶的buffer是什么，但是原理应该是一样的。所以建议你检查一下所以的buffer是否合适。
另外，酶切时可以在50ul 反应体系中加1ul的BSA，保护酶， 有利于酶切反应。同时在酶切时建议每隔10min轻轻混匀一下，保证酶切充分。
如果实在不行就只好分开做单酶切了。
希望对你有帮助。
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
3楼2013-12-11 08:50:33
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张爽00100

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ww贝尼 at 2013-12-11 08:41:41
我做过质粒的双酶切
做验证的话 10ul的体系  酶各0.5  质粒2.5  buffer分别为1ul、2ul  剩下用ddH2O补足10ul
胶回收 50ul的体系就可以，酶各2.5  质粒25   buffer分别为5ul、10ul 剩下 用ddH2O补足50ul

还有一个问题想请教下，酶切PCR产物时也是这样的体系吗?我之前按照我们实验室的体系做了几次连接，对照组也长菌，好郁闷啊
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4楼2013-12-11 08:54:36
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zct2008

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

另外，酶切时在50ul 反应体系中酶的量适当多加一点，每一种酶可以加2ul, 1ul感觉有点少。
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
5楼2013-12-11 08:56:56
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张爽00100

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zct2008 at 2013-12-11 08:50:33
首先你的反应体系应该是对的，没有什么问题。建议你看一下这两个双酶切：NcoI和BamH I;BamH I和XhoI，每一种酶各自的buffer是什么，双酶切时是否通用。例如BamH I和XhoI 这两个酶Takara公司的分别是buffer K和buffe ...

先谢谢了，关于双酶切的buffer，我查了，建议分别是1*tango和2*tango，但是公司还有这样一条建议
Buffer 2X Tango™
2-fold excess of BamHI
NcoI
Incubate at 37°C
这样是不是说BamH I是不是要多加一点啊
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6楼2013-12-11 09:13:55
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loveerobin

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我做过质粒的双酶切
做验证的话 40ul的体系  酶各1.0ul  buffer分别为4ul、8ul  用质粒26ul 补到40ul

另外，酶切之前先电泳检测一下你提的质粒的质量
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7楼2013-12-11 13:53:28
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zct2008

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 张爽00100 at 2013-12-11 09:13:55
先谢谢了，关于双酶切的buffer，我查了，建议分别是1*tango和2*tango，但是公司还有这样一条建议
Buffer 2X Tango™
2-fold excess of BamHI
NcoI
Incubate at 37°C
这样是不是说BamH I是不是要多加一点 ...

是的，加两倍的 BamHI
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
8楼2013-12-12 15:27:57
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张爽00100

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zct2008 at 2013-12-12 15:27:57
是的，加两倍的 BamHI...

谢谢了
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9楼2013-12-14 21:20:59
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