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yanzixiang

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-09 00:59:54
有载体自连,那你酶切载体的量是多少呢?
...

载体大概就是1μg,酶用的TAKARA的,加的1μL,都是按照说明书上做的
11楼2013-12-09 10:28:45
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yanzixiang

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by zh10246 at 2013-12-06 15:13:04
YOU CAN DO sequential digest.

能说的具体一些吗,不太懂
12楼2013-12-09 10:34:47
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by yanzixiang at 2013-12-09 10:34:47
能说的具体一些吗,不太懂...

1ug不算多,不行的话,可以继续降低载体的量,400ng也足够了,
顺序酶切就是先加一个酶,切2h,然后再补加另外一个酶继续切两个小时,然后跑胶回收
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
13楼2013-12-09 11:27:14
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lizanzan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可以先用一个酶切,过一段时间后直接在酶切体系中加另一个酶接着切
14楼2013-12-09 18:08:53
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yanzixiang

银虫 (小有名气)

比如我先用bam H1切一段时间,切开后Xba 1那个酶切位点上只有一对G\C可以看做是其保护碱基,但是当G\C作为xba1的保护碱基时,酶切2小时切开率也还是0%(参考NEB保护碱基表),这样能切开吗?先切Xba1也是这样。
15楼2013-12-09 19:36:03
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b6122

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by yanzixiang at 2013-12-09 06:36:03
比如我先用bam H1切一段时间,切开后Xba 1那个酶切位点上只有一对G\C可以看做是其保护碱基,但是当G\C作为xba1的保护碱基时,酶切2小时切开率也还是0%(参考NEB保护碱基表),这样能切开吗?先切Xba1也是这样。

那么能不能重新构建载体,在当前位点上做site directed mutation,插入更多的保护碱基

[ 发自小木虫客户端 ]
16楼2013-12-10 02:41:55
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yanzixiang

银虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by b6122 at 2013-12-10 02:41:55
那么能不能重新构建载体,在当前位点上做site directed mutation,插入更多的保护碱基
...

不知道怎么操作
17楼2013-12-10 10:07:12
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b6122

木虫 (正式写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by yanzixiang at 2013-12-09 21:07:12
不知道怎么操作...

thermo有一个相关的kit,也有protocol,你可以搜一下。

[ 发自小木虫客户端 ]
18楼2013-12-10 10:13:02
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