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新虫 (初入文坛)

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[求助] PCR的可重复性已有4人参与

最近，做实验出现了特别诡异的事件，之前PCR扩增很是顺利，中间出差一周后再换了新溶的引物，就怎么也扩不出来了。
这期间，DNA检测没有问题，浓度在27-30ng/ul之间，260/280值在1.7-1.9之间；稀释了DNA到10倍，50倍，100倍；引物是新的，别人也试过，引物没有问题；PCRmix也是新的，也换过牌子；换过PCR仪；换过操作的人.......
真是百思不得其解啊，望高人指点迷津啊，不甚感激！

此外，我在N篇文献上找到别人扩增的引物和PCR条件，引物都是通用的，结果用到自己的实验上就总是没有结果，实验一再的在重复重复，无望中~~~

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1楼 2013-11-29 09:57:14

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luwei13566

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-29 16:21:51

顺便问下，你检测的胶最下面的引物二聚体亮吗？？如果很亮的话建议少加点引物，最好做个温度梯度PCR，来个+-10度的，每个梯度P一管看看。
你的模板只稀释处理过吗？你的体系里模板加多少？？建议你不要稀释模板，反而应该加大模板的量。PCR的预变性时间稍微延长一些。
你PCR产物里有非特异性条带没，如果没有，退火时间、延伸时间都做延长处理。如果你的延伸时间原来2min，现在延长到4min,扩增循环到30，先不管杂带不杂带，先保证有带再说。~