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blckly

木虫 (小有名气)

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[求助] HepG2细胞生长缓慢及复苏后4至5天死亡

我在养的HepG2细胞，之前生长得很快的，一传六只需要48小时就可以长满到70%以上，但从几个月前开始，生长得特别慢，一传三，一周才能长满70% 左右，而且出现大量小黑点（如图片1），培养基用的是高糖DMEM培养基+10%的新生牛血清，换过批次，没有换厂家，也试过再加1%的非必须氨基酸，但通过加和不加的对照，发现没有区别，生长还是很慢。
请问有什么办法可以让它恢复快速生长？

另外尝试从-80度和液氮罐中取出冻存管复苏，复苏操作都是取出后直接投入37度水浴锅，至完全溶解后吸到离心管加培养基800转离心5分钟，复苏第一天贴壁正常，第二、三天生长是正常的，第三天开始，如果不传代，细胞将出现死亡（如图片2），传代后原代瓶中的细胞暂时不会死亡，但新瓶中的细胞状态很差，并出现大量小黑点，到一周左右，原代及传代瓶中所有细胞基本都死亡。而相同的操作在以前是可以正常复苏生长的。
请问这可能是什么原因引起的？应该怎么避免？这个问题不解决，我连买新的细胞都不敢买了。

谢谢！

图片1.JPG

图片2.JPG

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1楼2013-11-26 10:50:01

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blckly

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引用回帖:

2楼: Originally posted by forensic110 at 2013-11-26 13:16:27
我养过Hepg2细胞，刚复苏长得比较慢，它是成簇生长的，接种密度多点长得速度还行，大概2-3天长好了。
你的培养基没加双抗？复苏的时候讲究要快，在37度水里多摇两下，差不多化了就离心，时间不宜过长。建议离心后用 ...

以前生长速度是挺快的，也是成簇生长，开始现在接种密度一样的情况下，生长速度慢很多。
培养基加双抗和不加双抗都试过，连续一周，观察生长情况和小黑点量没有区别，不过现在还是加双抗的。
我的复苏操作在水浴锅解冻可能接近5分钟，这个时间可能太久了。我再试试操作快一点。
非常感谢！