| 查看: 2544 | 回复: 1 | ||
dengqiong301木虫 (小有名气)
|
[求助]
binding assay，有做过的看过来
|
|
小虫最近在做一个受体的binding assay，本来看着protocol很简单的实验做起来却是困难重重。 话说是研究某一个神经细胞系内表达的受体，突变了其中几个可能涉及到与对应激素结合的位点，想用放射性标记的方法来测定下binding效率。 问题就开始出现了，试了几次，都没有成功，问题罗列如下： 1 提取的cytosol的浓度太低，用了大概5-10个million的细胞/样本，用的是binding buffer （25mM Tris, 10%甘油，1mM EDTA, 20mM Na2MnO4, Protease Inhibitior以及5mM DTT）,低速离心收集细胞后，冻融三次，振动破碎细胞，100 000 g 4℃离心1小时取上清，测定蛋白浓度，蛋白的浓度特别低（用的是BCA测定法），只有不到1mg/ml。 2 做binding assay时，取了30微升的cytosol, 10微升的buffer (对照组用的是未标记的激素，400倍)，10微升的tracer （3H，50nM）,4度孵育2.5个小时后，加5mg dextran-coated的charcoal去除free的放射性激素，快速离心后取30微升测定radioactive count。得到的结果反而是对照组比较高，所有的结果基本上都是这个样子，所以就比较迷糊，请各位有经验的大神指点迷津，不甚感激。 |
回复此楼» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有155人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 求细胞粘附实验的具体步骤
已经有8人回复
- 如何在顶级科学杂志上发表论文.2 -鲁白(ZZ)
已经有11人回复
- 请教EMSA的有关问题
已经有9人回复
dengqiong301
木虫 (小有名气)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 1774.7
- 散金: 980
- 红花: 4
- 帖子: 172
- 在线: 104.6小时
- 虫号: 1414609
- 注册: 2011-09-23
- 性别: GG
- 专业: 发育生物学
2楼2013-11-24 06:59:10
