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dengqiong301木虫 (小有名气)
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binding assay，有做过的看过来
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小虫最近在做一个受体的binding assay，本来看着protocol很简单的实验做起来却是困难重重。 话说是研究某一个神经细胞系内表达的受体，突变了其中几个可能涉及到与对应激素结合的位点，想用放射性标记的方法来测定下binding效率。 问题就开始出现了，试了几次，都没有成功，问题罗列如下： 1 提取的cytosol的浓度太低，用了大概5-10个million的细胞/样本，用的是binding buffer （25mM Tris, 10%甘油，1mM EDTA, 20mM Na2MnO4, Protease Inhibitior以及5mM DTT）,低速离心收集细胞后，冻融三次，振动破碎细胞，100 000 g 4℃离心1小时取上清，测定蛋白浓度，蛋白的浓度特别低（用的是BCA测定法），只有不到1mg/ml。 2 做binding assay时，取了30微升的cytosol, 10微升的buffer (对照组用的是未标记的激素，400倍)，10微升的tracer （3H，50nM）,4度孵育2.5个小时后，加5mg dextran-coated的charcoal去除free的放射性激素，快速离心后取30微升测定radioactive count。得到的结果反而是对照组比较高，所有的结果基本上都是这个样子，所以就比较迷糊，请各位有经验的大神指点迷津，不甚感激。 |
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