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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] RT-qPCR

昨天做了一次荧光定量PCR，附件是扩增曲线以及溶解曲线。现在有几个问题想请教，内标的Ct值在8-9左右，可用吗？溶解曲线的高度代表什么？同时请结合附件图片对实验结果进行分析，谢谢！
RT-qPCR
Amplification Plot.jpg


RT-qPCR-1
Melt Curve.jpg
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1楼 2013-11-19 16:31:47
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
joan198108: 金币+1 2013-11-20 08:27:35
myprayer: 金币+1, 鼓励发贴积极交流。 2013-11-20 12:26:37
内标太高了吧，稀释一下
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2楼2013-11-19 18:37:41
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dnacomputer

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
joan198108: 金币+2, ★有帮助 2013-11-25 09:51:24
溶解曲线峰的高度就是荧光强度，与在特定温度下解链的DNA分子数目正相关。
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6楼2013-11-25 09:23:26
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普通回帖

joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-19 18:37:41
内标太高了吧，稀释一下

内标Ct偏低，但是目的基因Ct值在合理范围之内，稀释后可能导致目的基因的Ct值太高
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3楼2013-11-20 08:27:26
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yanfeier

金虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-21 01:30:13
溶解曲线代表是不是特异性扩增，溶解曲线正常了，才有判断的意义。个人认为。
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4楼2013-11-20 21:19:58
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yanfeier at 2013-11-20 21:19:58
溶解曲线代表是不是特异性扩增，溶解曲线正常了，才有判断的意义。个人认为。

是的，溶解曲线峰的单一性代表扩增的特异性，我想知道峰的高度代表什么
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5楼2013-11-21 08:09:47
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showman1989

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
joan198108: 金币+1 2013-11-26 08:21:35
内参需要稀释一定的倍数
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广交天下有才之士！绝不虚度人生。
7楼2013-11-25 09:51:44
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沙门小rna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
joan198108: 金币+1 2013-11-26 08:21:51
内参的ct也应该在18-28之间。ct太低了刚几个循环就到达荧光阈值了，那你目的基因不在这个范围内怎么比较呢
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应助之星就是我~没错。你没有看错~
8楼2013-11-25 15:55:31
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porphybaby

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
joan198108: 金币+2, ★有帮助 2013-11-26 08:23:04
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-26 15:27:42
熔解曲线高度应该不影响判断吧，就是荧光强度呗。可能你有的DNA多，有的少，所以就出来的不一样。

但峰位置一致。只要是一个峰就说明扩增得比较纯，没有非特异性扩增，定量的数据有效。
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9楼2013-11-25 23:33:46
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by showman1989 at 2013-11-25 09:51:44
内参需要稀释一定的倍数

你是说只在扩增内参的时候实习模板？
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10楼2013-11-26 08:21:28
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