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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 关于发酵液中蛋白提取
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
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laozuzunzhe: MicEPI+1, 鼓励热心应助！ 2013-10-30 21:17:14
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9楼: Originally posted by benedictchau at 2013-10-30 08:27:49
我想问一下3K的滤膜 超滤之后得到的滤液 一部分沸水浴 10min 另一部分保持原样牛津杯法测量  若煮沸的没有抑菌圈 能说明抑菌物质是蛋白质么  3K与蛋白质分子量单位如何转化啊？ 跪谢...

可以是可以，但是你的这个物质最好是能定量，确切知道进行了某一个处理之后能够保留多少。牛津杯法不知道能不能精确定量，这个方法挺麻烦的。

处理方法不宜一下子就进行两个，比如超滤和煮沸这两个，如果之前都不知道每一个方法的效果，结合起来就更加说不清了。哪一步处理之后有多纯，回收多少，最怕就是糊里糊涂的做，做完之后也还是糊里糊涂。

为什么要一开始就确定是不是蛋白质？假如是几个氨基酸残基的寡肽，没有二级结构的，即使是煮沸也不会灭活的。而即使是蛋白质，也不一定就不能耐受萃取中的有机溶剂，就像是某些酶能耐受高浓度有机溶剂，例如：
Biochemical characterization of an extracellular polyextremophilic alpha-amylase from the halophilic archaeon Halorubrum xinjiangense有机溶剂.pdf
Effect of non aqueous solvent on structural stability of alpha-amylase A cost-effective prospective for protein stabilization有机溶剂.pdf
2012年 有机溶剂 IF(2011)=1.683 Purification and characterization of an organic solvent-tolerant alkaline cellulase from a halophilic isolate of Thalassobacillus.pdf
2012年 有机溶剂 IF(2011)=2.735 Purification and characterization of an organic-solvent-tolerant cellulase from a halotolerant isolate, Bacillus sp. L1.pdf

最好就是设计一些方案来分离，按照分离效果来一步步减少杂质，最终得到纯品，这下子再鉴定就完全明白了，在此之前的都只能是猜测。别偷懒，在等待的时间里可以同时尝试，不要等菌长的时候就去看PPS。

你的这句“跑过活性电泳 有带但是回收后感觉没有抑菌活性了”是什么意思？“活性电泳”、“有带”、“回收”、“感觉”这四个词，我猜你的这个实验出了问题了，设计上或者操作上。活性电泳和非变性电泳是不同的，非变性电泳是保持非变性，但活性电泳不一定要保持非变性，只要能复性就行，而且要体现出活性。我猜你是跑了非变性电泳然后把蛋白质条带割下来回收了。这么做有一个前提，那就是这个物质肯定是蛋白质，而且能跑胶跑得出来，但其实这个物质还不一定是蛋白质。“感觉”这个词令我怀疑有没有准确定量。不管怎么说，还是把自己的实验步骤操作试剂分析放上来的好。
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    • 2013-10-30 19:09:03, 1.68 M
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
11楼2013-10-30 19:17:08
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benedictchau

铜虫 (小有名气)
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11楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-10-30 19:17:08
可以是可以，但是你的这个物质最好是能定量，确切知道进行了某一个处理之后能够保留多少。牛津杯法不知道能不能精确定量，这个方法挺麻烦的。

处理方法不宜一下子就进行两个，比如超滤和煮沸这两个，如果之前都 ...

谢谢您！！！
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12楼2013-10-31 09:03:50
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benedictchau

铜虫 (小有名气)
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11楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-10-30 19:17:08
可以是可以，但是你的这个物质最好是能定量，确切知道进行了某一个处理之后能够保留多少。牛津杯法不知道能不能精确定量，这个方法挺麻烦的。

处理方法不宜一下子就进行两个，比如超滤和煮沸这两个，如果之前都 ...

您好，我想问下活性电泳和非变性电泳在buffer 还有 燃料 还有电泳条件上有什么不同么？我查的都说是一个东西
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13楼2013-10-31 16:26:54
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冼亮淀粉酶

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生物大分子降解酶
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13楼: Originally posted by benedictchau at 2013-10-31 16:26:54
您好，我想问下活性电泳和非变性电泳在buffer 还有 燃料 还有电泳条件上有什么不同么？我查的都说是一个东西...

那你做过的那个实验到底是怎么做的，为什么不展示出来？不展示出来就不知道怎么改进。
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14楼2013-10-31 19:19:28
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benedictchau

铜虫 (小有名气)
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14楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-10-31 19:19:28
那你做过的那个实验到底是怎么做的，为什么不展示出来？不展示出来就不知道怎么改进。...

发酵液 10000R 8MIN 取上清，然后0.22微米的滤器过滤上清液，根据上清的量确定盐析所用硫酸铵的量（百分之五十），4℃ 过夜，8000r 10min 上清单独收集 0.02摩尔的ph 7.4tris缓冲液溶解所得的沉淀，现在就是要验证这些组分- -
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15楼2013-10-31 23:29:31
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15楼: Originally posted by benedictchau at 2013-10-31 23:29:31
发酵液 10000R 8MIN 取上清，然后0.22微米的滤器过滤上清液，根据上清的量确定盐析所用硫酸铵的量（百分之五十），4℃ 过夜，8000r 10min 上清单独收集 0.02摩尔的ph 7.4tris缓冲液溶解所得的沉淀，现在就是要验证 ...

对，这也是一种方法，可以起到分离效果，上清液也要测一下还有多少那个成分
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16楼2013-11-01 00:11:14
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benedictchau

铜虫 (小有名气)
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16楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-11-01 00:11:14
对，这也是一种方法，可以起到分离效果，上清液也要测一下还有多少那个成分...

现在是不确定我需要的活性物质到底是pr还是其他东西，所以验证起来有点迷糊
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17楼2013-11-01 07:53:27
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17楼: Originally posted by benedictchau at 2013-11-01 07:53:27
现在是不确定我需要的活性物质到底是pr还是其他东西，所以验证起来有点迷糊...

但是可以试着测定抑制效果，就是牛津杯法测得的抑制效果不算非常准确，但如果没有别的方法，就只能用目前所得得到的最准确的方法了，牛津杯法如果是现有所能找到最准确的方法，那就用吧。
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18楼2013-11-01 10:53:03
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