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serhhrr铁虫 (初入文坛)
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[求助]
大片段PCR扩增求助 已有4人参与
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| 我需要做一个RTPCR,扩增未知目的条带，大小约为3000bp，循环体系如下：94℃ 30s，54-60℃ 30s ， 72℃ 3-4min。酶的话用过LA Taq，Taq酶都用过，也换人操作过，可一直P不出来，求助各位高手！！ |
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【答案】应助回帖
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长片段PC不同于一般PCR的特殊要求： 1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。 2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了2020kd,甜茶碱可以少加点。 3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。 4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。 5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。 6.模板浓度最好在1ng/L以内。 7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。 8.设计较长的PCR引物（25-30 bp)。 我今天的回答比过去的同类问题的回答要简便，应该更容易操作一些。 |
19楼2014-07-08 01:58:07
2楼2013-10-23 16:04:49
serhhrr
铁虫 (初入文坛)
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3楼2013-10-23 16:52:20
taccycle
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4楼2013-10-23 17:17:02
