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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段PCR扩增求助
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serhhrr

铁虫 (初入文坛)

[求助] 大片段PCR扩增求助 已有4人参与

我需要做一个RTPCR,扩增未知目的条带，大小约为3000bp，循环体系如下：94℃ 30s，54-60℃ 30s ， 72℃ 3-4min。酶的话用过LA Taq，Taq酶都用过，也换人操作过，可一直P不出来，求助各位高手！！
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1楼 2013-10-23 15:50:04
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zcsy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-29 17:20:21
我以前试过2000bp 的扩增，有以下建议，希望对你有用：1、变性时间适当延长，有助于模板双链的打开。2、模板链的GC含量太高的话不易合成长链。不知道你的模板GC含量如何。建议用长链扩增的高保真酶。也可以试试MIX，MIX各组分比例比较适合，有助于PCR反应。3、退火时间太短4、将3000bp分段P，相互之间有交叉，这样可以后期测序拼接。
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加油！
18楼2014-01-02 19:39:50
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David勇

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-10-23 17:33:27
你是不是在做RACE？我也在做这个觉得挺难的。不过看资料好像混用一种高效的酶和保真的酶会比较有效。不过LA taq很多人都选这个做也能做出来。有人建议减少变性时间会有效。
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2楼2013-10-23 16:04:49
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serhhrr

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by David勇 at 2013-10-23 16:04:49
你是不是在做RACE？我也在做这个觉得挺难的。不过看资料好像混用一种高效的酶和保真的酶会比较有效。不过LA taq很多人都选这个做也能做出来。有人建议减少变性时间会有效。

嗯，变性时间？这个我没试过，别的都改变过来，模板也换过几次都没用呢
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3楼2013-10-23 16:52:20
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taccycle

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-10-23 17:33:37
首先啊这个模板质量会严重影响你的实验，做这种实验请确保你有高质量的模板！！！！其次你可以把PCR体系放大，把模板量加大，把延伸时间放长，比如放到6min没有问题的
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用心
4楼2013-10-23 17:17:02
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