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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 植物表达蛋白，能看到荧光，westernblot 却杂不出来，为什么？
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shan-sa

金虫 (正式写手)

[求助] 植物表达蛋白，能看到荧光，westernblot 却杂不出来，为什么？

在植物体中，表达了一个融合GFP的蛋白，看荧光是有的，然后取样做western，却杂不出来，阳性对照能杂出来，请问大家有没有遇到这种情况？
我把头皮想破了还是想不出为什么....谢谢！
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1楼 2013-10-22 10:03:39
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-25 13:20:21
转膜的过程还是应该存在一个蛋白质重折叠或者叫抗原修复的过程，不然抗原-抗体相互作用无法实现。

楼主的实验的另外原因：1.抗体失活，2.一抗与二抗不匹配，3.转膜不充分或者转膜过度，4.封闭膜的时间过长，5.酶和底物至少之一失活了，5.抗原失效（原因初楼外+蛋白质在膜上的量过少）。
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6楼2013-10-23 11:01:12
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feichen2008

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-23 10:38:14
有没有做阴性对照，看荧光阴性对照很重要，很有可能是自发荧光，植物都有自发荧光
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2楼2013-10-22 10:31:45
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shan-sa

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by feichen2008 at 2013-10-22 10:31:45
有没有做阴性对照，看荧光阴性对照很重要，很有可能是自发荧光，植物都有自发荧光

谢谢关注～阴性阳性都有。而且可以确定是荧光。
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3楼2013-10-23 08:46:42
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-10-23 10:38:19
最可能的一种情况，目的蛋白质与GFP共价连接后的新的蛋白质的空间结构发生了改变，GFP那部分还是天然构象，但是目的蛋白的表位因为目地蛋白质折叠异常或者因为GFP形成的空间位阻使得抗原表位被遮盖。可以用蛋白质的三维结构预测软件预测一下目的蛋白质与GFP共价连接后的新的蛋白质的空间结构，看看目的蛋白质的构象与天然构象是不是发生了改变。

目的蛋白质与GFP共价连接之间的肽链也该是数个亲水的氨基酸残基，这样对于目的蛋白质与GFP各自的折叠影响较小。
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4楼2013-10-23 10:16:28
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