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胡化静

木虫 (小有名气)

[求助] sfiI和NotI双酶切

我想做sfiI和NotI双酶切,因为两者酶切Buffer不一样,所以只能单酶切。如图,第2、3泳道是先sfiI单酶切,然后在混合物中直接加入NotI及Buffer,进行NotI单酶切。结果看不见切下的700bp片段,只有四千多的大片段。第4、5泳道是先sfiI单酶切,然后电泳、胶回收,进行NotI单酶切。结果就看不见条带了。我该怎么切,才能切下来?
sfiI和NotI双酶切
无标题-1.jpg
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啦啦啦
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胡化静

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by woai43 at 2013-10-18 16:48:50
两个酶buffer不同还是需要单酶切后再回收吧。你sfiI单酶切割胶回收后有没有电泳检测?有可能你胶回收损失太多了,后面再进行NotI单酶切由于没有DNA了所以电泳就看不到了。你第一个酶切过先电泳看下DNA的量,再做第二 ...

好的,我试试。
啦啦啦
4楼2013-10-18 18:57:13
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woai43

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
胡化静: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-10-18 18:58:23
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-10-19 01:26:32
两个酶buffer不同还是需要单酶切后再回收吧。你sfiI单酶切割胶回收后有没有电泳检测?有可能你胶回收损失太多了,后面再进行NotI单酶切由于没有DNA了所以电泳就看不到了。你第一个酶切过先电泳看下DNA的量,再做第二个酶切。
2楼2013-10-18 16:48:50
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xiaozhou0904

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-10-19 01:26:39
由于两个酶的要求温度或是条件不同,建议做完第一刀酶切,做PCR回收,然后再做第二次酶切!
3楼2013-10-18 17:00:28
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