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gene121木虫 (著名写手)
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[求助]
谁做过毕赤酵母pPICzalpha的构建？请帮忙
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谁做过毕赤酵母pPICzalpha的构建，请问 1.构建的时候，有没有什么地方要注意的，尤其是酶切位点的选择，是不是不需要考虑起始位点，只要外源基因插进去，插到多克隆位点处，方向对了就行，还是有要求？ 2.博来霉素，有没有便宜的厂家推荐下， 谢谢，这玩意太TM贵了，用不起啊！ 3.pPICzalpha质粒系列里面的 A B C D有什么区别？是不是位点不一样？ 请做过的同志详细解答下，如果可以，我会追加金币至100！谢谢！ |
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【答案】应助回帖
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gene121(kx444555代发): 金币+6, 鼓励交流 2013-10-26 22:04:04
gene121: 金币+14 2014-04-17 14:23:37
gene121(kx444555代发): 金币+6, 鼓励交流 2013-10-26 22:04:04
gene121: 金币+14 2014-04-17 14:23:37
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我最近也在弄关于毕赤酵母表达的载体用的是PpiczαA。本人实验还处与设计阶段。你问的问题除了第二个，第一个问题和第三个问题说明书里都有的。我只能给你建议，你可以考证是否正确但是我的引物已经去合成了，我认为我的对，但是涉及到你自己的实验，一定要多重考证我说的话。 1.你要构建时首先要考虑酶切位点用哪个，如果你要用Ppiczα系列，我劝你XHO Ⅰ这个位点不要用，这个位点在这个载体之中有两个，其中一个位于KEX2酶切位点之前，你要是用的话必须在上游引物把这个位点补齐，后期还要筛选正反向的问题。我没用这个酶切位点太麻烦了，我用的是ECORⅠ，xbaⅠ。你选择自己的酶切位点首先要考虑你选的酶切位点在你的目的基因里面一定不要有。然后就是这两个酶切位点要有共用的BUFFER。然后方向搞清楚。再就是千万别移码。我的下游引物除了保护性碱基，酶切位点之外多加了两个碱基，确保不移码，这个千万要记住啊（移码这个问题，做表达的时候是必须考虑的）。 第二个问题：不知道 第三个问题：A,B,C之间的区别是PstⅠ这个位点只存在B载体中。Cla这个位点只存在于C载体中。 还有就是你看看关于这个载体的说明书吧 |
2楼2013-10-26 21:18:38