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9.0kb载体与2.4kb片段为什么用T4连接酶连接，没有得到阳性克隆？
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片段处理方法如下：2.4kb的PCR片段经过跑胶切胶回收，浓度为100ng/ul，然后双酶切，酶切体系如下:4ul 切胶回收的PCR片段 24ul（2.4ug）, BamH1-HF(NEB公司）1.5ul, Not1-HF（NEB公司）1.5ul, 10*Buffer 3ul，共30ul酶切体系，37度酶切过夜。PCR产物双酶切后使用全式金公司凝胶回收试剂盒过柱子纯化，即将30ul反应体系直接加入到3倍体积的溶胶溶液，混匀后直接上柱子纯化，跑胶检测纯化后的片段浓度为40ng/ul。 载体处理方法如下：9.0kb的载体双酶切，双酶切体系如下：5ug载体，BamH1-HF(NEB公司）1.5ul, Not1-HF（NEB公司）1.5ul, 10*Buffer 3ul，用无菌水补足至30ul，也是37度酶切过夜。然后切胶回收大的载体片段，跑胶检测纯化后的载体浓度为20ng/ul。 连接&转化：用NEB公司的T4连接酶进行连接，连接体系如下：片段6.5ul，载体8.5ul，10*buffer 3ul，T4 ligase 2ul，无菌水10ul，总体积30ul，摩尔比为10：1，室温连接1.5h，然后进行转化。做了一个转化质粒的对照，保证转化过程没有出现问题。转化平板在37度生长16h。 结果：转化平板上只长了8个菌落，全部挑取做菌落PCR，发现没有阳性克隆。 请求大家帮我找找原因。 |
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