| 查看: 2015 | 回复: 7 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
9.0kb载体与2.4kb片段为什么用T4连接酶连接，没有得到阳性克隆？
|
||
|
片段处理方法如下：2.4kb的PCR片段经过跑胶切胶回收，浓度为100ng/ul，然后双酶切，酶切体系如下:4ul 切胶回收的PCR片段 24ul（2.4ug）, BamH1-HF(NEB公司）1.5ul, Not1-HF（NEB公司）1.5ul, 10*Buffer 3ul，共30ul酶切体系，37度酶切过夜。PCR产物双酶切后使用全式金公司凝胶回收试剂盒过柱子纯化，即将30ul反应体系直接加入到3倍体积的溶胶溶液，混匀后直接上柱子纯化，跑胶检测纯化后的片段浓度为40ng/ul。 载体处理方法如下：9.0kb的载体双酶切，双酶切体系如下：5ug载体，BamH1-HF(NEB公司）1.5ul, Not1-HF（NEB公司）1.5ul, 10*Buffer 3ul，用无菌水补足至30ul，也是37度酶切过夜。然后切胶回收大的载体片段，跑胶检测纯化后的载体浓度为20ng/ul。 连接&转化：用NEB公司的T4连接酶进行连接，连接体系如下：片段6.5ul，载体8.5ul，10*buffer 3ul，T4 ligase 2ul，无菌水10ul，总体积30ul，摩尔比为10：1，室温连接1.5h，然后进行转化。做了一个转化质粒的对照，保证转化过程没有出现问题。转化平板在37度生长16h。 结果：转化平板上只长了8个菌落，全部挑取做菌落PCR，发现没有阳性克隆。 请求大家帮我找找原因。 |
回复此楼» 猜你喜欢
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有140人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
化工申博
已经有3人回复
-
申博自荐
已经有2人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 直接PCR产物转化的克隆新方法，不需要限制酶和连接酶（正式出版pdf版）
已经有78人回复
- 求助具体的（具体的）无连接酶亚克隆法全步骤，从PCR到克隆
已经有13人回复
- 【求助/交流】宝生物T连接用的solution1可以代替T4连接酶吗？
已经有9人回复
yang0071
木虫 (职业作家)
- 应助: 207 (大学生)
- 金币: 1573.4
- 散金: 9319
- 红花: 21
- 帖子: 4041
- 在线: 647.7小时
- 虫号: 50941
- 注册: 2004-07-15
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
6楼2013-10-12 16:58:28
yang0071
木虫 (职业作家)
- 应助: 207 (大学生)
- 金币: 1573.4
- 散金: 9319
- 红花: 21
- 帖子: 4041
- 在线: 647.7小时
- 虫号: 50941
- 注册: 2004-07-15
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
2楼2013-10-12 15:49:46
3楼2013-10-12 15:58:28
yang0071
木虫 (职业作家)
- 应助: 207 (大学生)
- 金币: 1573.4
- 散金: 9319
- 红花: 21
- 帖子: 4041
- 在线: 647.7小时
- 虫号: 50941
- 注册: 2004-07-15
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
4楼2013-10-12 16:01:59
5