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挫人小鱼

新虫 (小有名气)

[求助] HeLa细胞传代后90% 死亡，求解

本人菜鸟，才开始学养细胞。

替别人传 细胞，结果HeLa细胞状态好，长的太快，本是第二天下午传的，结果没时间，第三天中午传的。因为细胞长的很满，不过也有很多死细胞，就一个大瓶传了一个中瓶，两个大瓶。镜检，三个瓶子中细胞浓度很大。根据以前的经验，长一天绝对很满。结果第四天早上，也就是今天早晨看的时候，90%的细胞飘起来了，只有10%细胞贴壁生长，而且状态不好。
这次的培养基是新配的，初步认为可能是新配置的培养基没有混合均匀，因为我加入FBS和双抗之后，只是左右晃动几下培养基，10min之后开始用这个培养基（配置培养基后才开始消化细胞），不知道是不是这个原因。
双抗是找别人借的，人家说浓度是100 X 的。DMEM是新的，FBS是用过的，冰箱放置了约3天吧。

其次是前天传了一批自己养的HeLa细胞，培养基是以前的，昨天看还是可以的，死细胞不多，只是贴壁细胞不多，但是今天早上看的时候，也是很多死细胞，状态不好，不知道什么原因。

不知道是不是污染导致这些细胞离我而去？求大侠们解答。
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1楼 2013-09-29 12:12:45
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挫人小鱼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 超然渡陈 at 2013-09-30 14:09:30
传代后状态不好或者死的一般就四个原因：1.接触细胞的液体温度过低2.胰酶浓度过高或者消化时间过长3.吹打分散时力度过大或吹打时间过长4.细胞污染。你的DMEM培养基从4℃冰箱拿出来之后有没有经过温箱复温？一般在换 ...

嗯，以后会注意一下。
传代前没有提前把PBS，胰酶，培养基放在37摄氏度温箱，我是中瓶转大瓶，中瓶里面胰酶是2ml，加入20ml培养基。
胰酶是买的，他们一般是小瓶1ml中瓶2ml，大瓶2.5ml这么加的。
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12楼2013-10-07 17:50:22
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arystal

金虫 (小有名气)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-29 20:25:18
会不会是胰酶消化的时间过久了；或者是吹散成单细胞悬液的时候，力道过大了，影响到细胞状态了？
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2楼2013-09-29 13:46:27
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挫人小鱼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by arystal at 2013-09-29 13:46:27
会不会是胰酶消化的时间过久了；或者是吹散成单细胞悬液的时候，力道过大了，影响到细胞状态了？

胰酶消化时间是8min，有些细胞漂浮起来了才停止消化；我以为是细胞长老了，所以消化时间较久。
吹打细胞貌似是一直这么吹的，以前的还好。

听实验室师妹说可能是FBS不够，导致细胞饿死了。不知道是不是。
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3楼2013-09-29 16:22:30
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梦幻未碎

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-29 20:25:27
gyesang: 回帖置顶 2013-09-29 20:25:32
挫人小鱼: 金币+3 2013-10-07 17:46:48
亲！细胞消化只要肉眼可见培养瓶底部细胞脱落就可以加培养基进行轻柔吹打，一般消化在1~2min，具体以观察为准。消化8分钟居然还能有10％活细胞真的是奇迹了。。。。
培养液里面有没有脏脏的感觉？
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开阔
4楼2013-09-29 17:01:58
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