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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助。。细胞爬片时出现的像金针菇一样的东西肿么破%>_<%
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榆榆april

银虫 (小有名气)

[求助] 求助。。细胞爬片时出现的像金针菇一样的东西肿么破%>_<%

向各位有经验的虫友们求助。。
本人是学化学的，做细胞实验属于门外汉的那一种。。
想做细胞爬片染荧光之后去看共聚焦，但是做了几次都出现如照片所示的奇怪的东西，实在分析不出来是哪做错了，还请大家指点。。
实验步骤如下：
1.24孔板放了圆形盖玻片之后种板
2.第二天加材料，共培养24 h
3.除去培养基之后，PBS洗两次，加入4%的多聚甲醛固定
4.压过的超纯水洗两次，PBS洗一次之后染线粒体，37度20 min
5.PBS洗三次之后染核，用的是DAPI，室温5 min
6.PBS洗三次把盖玻片取出，扣在滴了一滴抗荧光猝灭封片液的载玻片上
7.荧光显微镜观察，明场下就能看到如照片中所示的情况

直接看片子时可以看到有照片中那样情况的地方是白蒙蒙的，只有透亮的地方才能看到干净的细胞，白蒙蒙的地方就像是细胞被什么压住了一样，融为一体了，调焦也不能把这个像金针菇一样的东西和压在下面的细胞区分开，这样我每一个片子上就只有一小块细胞是能看的，其他都被这个金针菇压住了，很是费解，不知道是哪做错了。。。

爬片爬的心都要碎了，总是做不好，还请大家指点。。

虽然盖玻片和载玻片没有酸洗灭菌，但是似乎不是他们的原因，我把盖玻片扣到滴了一滴PBS的载玻片上在镜下看没有金针菇。。
不用封片液，直接扣盖玻片到载玻片上却还是有金针菇。。。

请大家帮我分析一下原因，说的太啰嗦了，实在是搞不定。。求助。。求救。。
求助。。细胞爬片时出现的像金针菇一样的东西肿么破%>_<%
20130923_133354.jpg


求助。。细胞爬片时出现的像金针菇一样的东西肿么破%>_<%-1
20130923_141458.jpg
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1楼 2013-09-23 16:37:38
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conanzzz

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢参与 2013-09-24 02:10:47
玻璃片没洗干净或者质量不好？再调调焦距能好些么？或者会不会没有封片水分干了成结晶了
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2楼2013-09-23 17:24:20
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榆榆april

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by conanzzz at 2013-09-23 17:24:20
玻璃片没洗干净或者质量不好？再调调焦距能好些么？或者会不会没有封片水分干了成结晶了

玻片木有处理，但是不是玻片的问题，因为空白玻片看不到这个金针菇。。
焦距也调不出来。。
不过话说是扣上盖玻片之后马上就要封片么？
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3楼2013-09-23 18:21:39
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conanzzz

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
榆榆april: 金币+5, ★有帮助, 谢谢！ 2013-09-24 09:22:39
榆榆april: 金币+2, 谢谢，我再试试。 2013-09-28 18:31:20
引用回帖:
3楼: Originally posted by 榆榆april at 2013-09-23 18:21:39
玻片木有处理，但是不是玻片的问题，因为空白玻片看不到这个金针菇。。
焦距也调不出来。。
不过话说是扣上盖玻片之后马上就要封片么？...

最好封片,要不时间久了干片的话盐应该会结晶吧
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4楼2013-09-24 00:13:42
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0640409

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
榆榆april: 金币+2, ★有帮助, 谢谢，我试试，如果有问题再询问大家~非常感谢！ 2013-09-28 18:29:08
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-09-30 08:37:52
盖玻片载玻片没有酸洗灭菌，怎么保证无菌呢，你要证明不是不是玻璃片的问题就放一个未爬细胞玻璃片在培养基中一起培养处理，再观察，否则没意义。看起来还有可能是盐的结晶
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5楼2013-09-24 10:39:28
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
榆榆april: 金币+2, ★有帮助, 谢谢，我试试，如果有问题再询问大家~非常感谢！ 2013-09-28 18:29:36
析出的盐结晶。制片到观察时间太长，液体干了。封片或在显微镜边上制片立即观察。
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6楼2013-09-26 13:17:39
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榆榆april

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-26 13:17:39
析出的盐结晶。制片到观察时间太长，液体干了。封片或在显微镜边上制片立即观察。

其实就是制片之后就观察了的，不知道片子从板里扣出来的时候需不需要把多余的粘在上面的PBS吸掉再扣到盖玻片上？感觉我的封片液加的也多了，有时候都流动了。。这个盐结晶让我很费解呀。。。
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7楼2013-09-28 18:31:03
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hl16010921

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 榆榆april at 2013-09-28 18:31:03
其实就是制片之后就观察了的，不知道片子从板里扣出来的时候需不需要把多余的粘在上面的PBS吸掉再扣到盖玻片上？感觉我的封片液加的也多了，有时候都流动了。。这个盐结晶让我很费解呀。。。...

封片液主要成分是甘油，一定要将液体吸尽，否则会直接析出盐（相当于向PBS直接加甘油），但加甘油后会多多少少失水导致细胞变形。可以试试不加封片的效果，不行再封片。如果是倒置的荧光，可以试试不爬片，直接观察，有时效果很好。
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8楼2013-09-28 19:12:03
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榆榆april

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-28 19:12:03
封片液主要成分是甘油，一定要将液体吸尽，否则会直接析出盐（相当于向PBS直接加甘油），但加甘油后会多多少少失水导致细胞变形。可以试试不加封片的效果，不行再封片。如果是倒置的荧光，可以试试不爬片，直接观察 ...

谢谢！其实是想爬片了去做共聚焦，现在总爬不好就只能用共聚焦专用皿了，成本比较高。。我记得有一次我没加封片液倒扣在载玻片上也出现了这个金针菇，于是我就排除了封片液的问题了。。还请问吸走PBS的时候是不是用普通的吸水纸就可以？或者其他的什么比较好用的？
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9楼2013-09-29 18:46:44
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hl16010921

木虫 (正式写手)
还是液体干了。我又查了一下别人的做法，据说这样是最好的：pBS洗后，吸去多余的水分，加封闭液，用指甲油封边，一定要用指甲油封边防止水分蒸发。我当年是不断补水盐溶了再照的。要是倒置的共聚焦倍数不高的话也可以直接在孔里看。
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10楼2013-09-29 20:49:52
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