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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » FRET里accpetor荧光强度太低
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

[求助] FRET里accpetor荧光强度太低 已有1人参与

我设计了个FRET实验观察两个蛋白相互作用,一个用Fluorescein(donor)标记了,另一个用TAMRA(acceptor)标记.
在诱导相互作用以后,我可以明显地看到fluorescein(donor)荧光强度下降了50%-70%, 但是TAMRA(acceptor)的荧光根本观察不到
后来我直接用acceptor的激发波长激发acceptor,发现acceptor的荧光亮度仅仅是donor荧光亮度的1/8到1/10,估计是荧光转化效率太低,两个放在一起就被donor的荧光盖住了,(donor在acceptor的发射波长范围也有很弱的荧光)
有没有什么办法能够降低donor的荧光效率,或者证明FRET确实发生了?因为我要是把这样的结果给审稿人,审稿人看不到acceptor的变化,肯定不相信我的数据啊
我想能不能把TAMRA(acceptor)给光漂白了,尝试观察Fluorescein(donor)的重新上升?有亲这么做过吗?
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
1楼 2013-09-23 09:25:17
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
补充一下,我有做过阴性对照,把只有donor标记的蛋白和未标记的蛋白诱导相互作用,看不到荧光变化
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2013-09-23 09:26:47
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-24 21:31:02
荧光强度低有可能是合成的荧光蛋白质量有问题吧？ 建议换一种波长和donor相距较远的
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我会绕一个圈，走回到实验室
3楼2013-09-23 10:12:13
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夕颜醉清风

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

同样遇到一样的问题。我的是Cy3-Cy5 分子对，Cy5荧光强度非常低，
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4楼2019-07-25 21:54:49
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