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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物设计
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-09-22 21:19:07
楼主说酶含有内含子？？你是想说你要扩的基因含有内含子吧？假如你要扩的序列是已知的，即有完整的CDS区，那么，引物很好设计，直接CDS区两端写应该都可以扩出来的，如果你的是未知的，那么你就要做RACE，如楼上有朋 ...

首先非常感谢，我有这个酶的完整的cDNA序列，我在这个CDNA序列的两端设计过引物，可是扩不出来，我也 不知道是什么原因，我想是不是因为我设计的引物有可能在以基因组为模板的时候被内含子隔断了呢？我的酶是植物中的一个酶。
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
11楼2013-09-23 10:58:56
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守望者047

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-28 20:40:02
引用回帖:
9楼: Originally posted by 崔永霞 at 2013-09-22 14:30:10
需要设计很多对引物是什么意思啊？...

做race需要一段一段的PCR，直到把基因的全序列都p出来，当然要设计很多对引物，而且需要很长的时间才能完成，祝你好运
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数往者顺，知来者逆！
12楼2013-09-24 11:11:54
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by laojiu9878 at 2013-09-22 09:45:41
做简并引物，还是已经有序列直接扩；不同的注意点不同，要多考虑，或者查文献看别人是否设计过

1 只有一个完整的cdna编码序列，顺便说一下，这个植物的基因组到现在还没有测出来。
2 我是要以DNA 为模板设计引物，所以引物不好设计啊！
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
13楼2013-09-25 20:37:31
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-09-22 21:19:07
楼主说酶含有内含子？？你是想说你要扩的基因含有内含子吧？假如你要扩的序列是已知的，即有完整的CDS区，那么，引物很好设计，直接CDS区两端写应该都可以扩出来的，如果你的是未知的，那么你就要做RACE，如楼上有朋 ...

我是在CDS的两端设计的上下游引物啊，分别跨过了起始密码子和终止密码子，可是还是扩不出来啊？我也不不知道原因是什么？我是以DNA为模板的，是不是不应该是以DNA为模板啊？应该是提RNA，然后反转录，再然后以CNA为模板扩增 啊？
谢谢啦？
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
14楼2013-09-25 20:42:42
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
崔永霞: 金币+1, ★有帮助 2013-09-27 12:41:12
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-28 20:40:13
引用回帖:
14楼: Originally posted by 崔永霞 at 2013-09-25 20:42:42
我是在CDS的两端设计的上下游引物啊，分别跨过了起始密码子和终止密码子，可是还是扩不出来啊？我也不不知道原因是什么？我是以DNA为模板的，是不是不应该是以DNA为模板啊？应该是提RNA，然后反转录，再然后以CNA为 ...

可以以DNA为模板，你的扩增体系及程序有无问题呢？你的退火温度各方面是否合适？你怀疑引物有问题，那好办，交给生工或其他一些公司，让专业的人帮你设计，免费的。
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思路决定出路。。。
15楼2013-09-26 17:07:52
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-09-26 17:07:52
可以以DNA为模板，你的扩增体系及程序有无问题呢？你的退火温度各方面是否合适？你怀疑引物有问题，那好办，交给生工或其他一些公司，让专业的人帮你设计，免费的。...

那以DNA 为模板的话，我设计的引物是不是很有可能被内含子隔断啊，我做的这个酶是植物中的，而且这种植物的基因组到现在还没有公布？
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
16楼2013-09-27 12:41:05
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
崔永霞: 金币+1, ★有帮助, 非常感谢！ 2013-09-28 11:42:12
引用回帖:
16楼: Originally posted by 崔永霞 at 2013-09-27 12:41:05
那以DNA 为模板的话，我设计的引物是不是很有可能被内含子隔断啊，我做的这个酶是植物中的，而且这种植物的基因组到现在还没有公布？...

有可能，那你就提RNA再反转录PCR，注意要消化掉DNA。
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思路决定出路。。。
17楼2013-09-27 14:06:43
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沙门小rna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
崔永霞: 金币+1, ★有帮助 2013-09-28 11:43:56
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-28 20:40:21
引物设计是很重要，但是你也要看看你的引物和pcr其他组分是不是有问题。还应该在pcr条件上做调节。梯度温度试试没有？你是用什么软件设计的？
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应助之星就是我~没错。你没有看错~
18楼2013-09-27 14:50:18
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 沙门小rna at 2013-09-27 14:50:18
引物设计是很重要，但是你也要看看你的引物和pcr其他组分是不是有问题。还应该在pcr条件上做调节。梯度温度试试没有？你是用什么软件设计的？

梯度温度也试过了，我是用primer5设计的。
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
19楼2013-09-28 11:43:36
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沙门小rna

金虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 崔永霞 at 2013-09-28 11:43:36
梯度温度也试过了，我是用primer5设计的。...

不会吧？多长的片段啊？用的酶和其他东西check了吗？延伸时间，循环数呢？
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应助之星就是我~没错。你没有看错~
20楼2013-10-11 21:57:47
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