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木本植物茎及叶RNA提取难题 已有4人参与
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如题，样品基本不是幼嫩组织，是成熟组织，给过药的，不是很好提，已经试了很多种方法了，包括天净沙RNAout提取试剂盒、OMEGA的RNA提取试剂盒、异硫氰酸胍-SDS法、CTAB小量RNA法，但是跑电泳显示提取的效果不好。异硫氰酸胍-SDS法、CTAB小量RNA法可以提出来RNA，前者提出来的已降解，后者提出来的量很少，首次电泳隐约可见，再跑电泳竟然看不见了。天净沙试剂盒提取的就是降解的5S条带，很亮。 关于RNA的提取，用异硫氰酸胍-SDS法曾经提出来质量很好的，可是就是不稳定，偶尔好，偶尔不好，多数是不好的，降解的。 样品应该也没问题，因为是刚采不久的。至于会不会取材时间有点长，可能取样4~5min才放到液氮会不会有影响就不好说。但是我看别人采样，从采样到清洗足足有半小时的，提出来的RNA也没有问题啊！ 关于操作，说真的，一直没有人带，自己摸的，看了不少相关资料的，试剂是事先预冷的，管是DEPC泡过的，枪头买无酶的，直接取用。研磨是，叶子好磨，磨得很细的。木本茎不好磨，不管磨多久，肉眼看已经很细了，还是发现有少量木屑离心后会飘着，但98%都已经磨成很细的，理论不会有很大影响才对。 去蛋白取上清，我都是小心翼翼的，总是留下100~200uL不取，防止蛋白和DNA污染，别人有时取了蛋白也不会很影响，我不知道，我咋人品这么差了！当然提的组织不一样。 提RNA我觉得最重要的是保证样品新鲜、研磨充分，操作要快，去蛋白不要取到中间层，冰上操作。。。可惜啊，自己提了那么多次就是不好，不知道为什么，我承认我现在很有挫败感，希望大家多多指点，小心脏快受不了！ 以下上传2张图片，希望大家给点意见啦~  1.jpg上面3个条带，从左到右，分别是叶、叶、茎、茎，有一个茎没出来，下面在同一块胶上跑的好的是其他物种的茎叶，都是天净沙试剂盒提的  2.jpg这个亮的是异硫氰酸胍法提的，降解了，较弱的是小提RNA法提取的，都是叶子，茎的没出来，OMEGA的全部无条带 [ Last edited by 一池荷 on 2013-9-17 at 15:55 ] |
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liutong1026
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5楼2013-09-27 21:34:04
xfyangsibs
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-17 10:39:22
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| 用进口盒子吧。如果有DNA污染就除一下DNA，其实如果做反转录的话，RNA有一点就够啦，不需要要求那么高，只要跑胶能看到就接着往下做，毕竟任何实验都不是一朝一夕的功夫，多做几次，稳定一种方法就好了。一直换方法反而是得不偿失的事情，还不如好好摸好一种你觉得目前最靠谱的办法。我没记错的话，植生所做木薯的张鹏他们发过一篇大戟科的RNA提取办法，可能比你这个还难以提取。作者可能包含Jia Xu, Xiaoguang Duan, Peng Zhang. 你看看能不能找到。Tips 和 Tubes 建议都直接买 RNase free的，不要自己处理了。各类进口品牌的质量都蛮可靠的。 |
10楼2013-10-17 09:43:35
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huayueyang
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