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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 木本植物茎及叶RNA提取难题
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一池荷

铁虫 (初入文坛)

[交流] 木本植物茎及叶RNA提取难题 已有4人参与

如题，样品基本不是幼嫩组织，是成熟组织，给过药的，不是很好提，已经试了很多种方法了，包括天净沙RNAout提取试剂盒、OMEGA的RNA提取试剂盒、异硫氰酸胍-SDS法、CTAB小量RNA法，但是跑电泳显示提取的效果不好。异硫氰酸胍-SDS法、CTAB小量RNA法可以提出来RNA，前者提出来的已降解，后者提出来的量很少，首次电泳隐约可见，再跑电泳竟然看不见了。天净沙试剂盒提取的就是降解的5S条带，很亮。
    关于RNA的提取，用异硫氰酸胍-SDS法曾经提出来质量很好的，可是就是不稳定，偶尔好，偶尔不好，多数是不好的，降解的。
    样品应该也没问题，因为是刚采不久的。至于会不会取材时间有点长，可能取样4~5min才放到液氮会不会有影响就不好说。但是我看别人采样，从采样到清洗足足有半小时的，提出来的RNA也没有问题啊！
     关于操作，说真的，一直没有人带，自己摸的，看了不少相关资料的，试剂是事先预冷的，管是DEPC泡过的，枪头买无酶的，直接取用。研磨是，叶子好磨，磨得很细的。木本茎不好磨，不管磨多久，肉眼看已经很细了，还是发现有少量木屑离心后会飘着，但98%都已经磨成很细的，理论不会有很大影响才对。
    去蛋白取上清，我都是小心翼翼的，总是留下100~200uL不取，防止蛋白和DNA污染，别人有时取了蛋白也不会很影响，我不知道，我咋人品这么差了！当然提的组织不一样。
     提RNA我觉得最重要的是保证样品新鲜、研磨充分，操作要快，去蛋白不要取到中间层，冰上操作。。。可惜啊，自己提了那么多次就是不好，不知道为什么，我承认我现在很有挫败感，希望大家多多指点，小心脏快受不了！
     
     以下上传2张图片，希望大家给点意见啦~
木本植物茎及叶RNA提取难题
1.jpg上面3个条带，从左到右，分别是叶、叶、茎、茎，有一个茎没出来，下面在同一块胶上跑的好的是其他物种的茎叶，都是天净沙试剂盒提的


木本植物茎及叶RNA提取难题-1
2.jpg这个亮的是异硫氰酸胍法提的，降解了，较弱的是小提RNA法提取的，都是叶子，茎的没出来，OMEGA的全部无条带

[ Last edited by 一池荷 on 2013-9-17 at 15:55 ]
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1楼 2013-09-17 15:53:18
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liutong1026

铜虫 (小有名气)
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-29 19:42:50
我们也在提木本的RNA，用百泰克的盒子，师兄取老木头用电钻钻取，然后马上装离心管丢液氮里，细点的枝条用转笔刀取，提的还不错来，，，提RNA关键就是取样快
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5楼2013-09-27 21:34:04
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xfyangsibs

银虫 (初入文坛)
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-17 10:39:22
用进口盒子吧。如果有DNA污染就除一下DNA，其实如果做反转录的话，RNA有一点就够啦，不需要要求那么高，只要跑胶能看到就接着往下做，毕竟任何实验都不是一朝一夕的功夫，多做几次，稳定一种方法就好了。一直换方法反而是得不偿失的事情，还不如好好摸好一种你觉得目前最靠谱的办法。我没记错的话，植生所做木薯的张鹏他们发过一篇大戟科的RNA提取办法，可能比你这个还难以提取。作者可能包含Jia Xu, Xiaoguang Duan, Peng Zhang. 你看看能不能找到。Tips 和 Tubes 建议都直接买 RNase free的，不要自己处理了。各类进口品牌的质量都蛮可靠的。
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10楼2013-10-17 09:43:35
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一池荷

铁虫 (初入文坛)
没人回复啊，难道因为没有金币？那这样的话，我愿奉上所有金币，只是我不知道怎么改回求助帖
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2楼2013-09-17 20:44:10
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huayueyang

新虫 (小有名气)
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-28 22:37:51
盒子，找厉害的，天根或者华越洋的。再要不然用qiagen的。你说的哪两个我们这么多实验室都没听说过。有明显的DNA污染。ctab法加licl沉淀法试试。
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坚持！
3楼2013-09-24 16:24:28
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一池荷

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huayueyang at 2013-09-24 16:24:28
盒子，找厉害的，天根或者华越洋的。再要不然用qiagen的。你说的哪两个我们这么多实验室都没听说过。有明显的DNA污染。ctab法加licl沉淀法试试。

谢谢，总算有人回复了！我昨天用异硫氰酸胍法提取了一批茎，全部三条带，很完整未降解，就是有DNA污染，另外用CTAB-LiCL法提取叶子及茎，结果还是没有条带。用天根的植物RNA提取试剂Trizol提取叶片，260/280为2.0左右，500ng/ul，稀释5倍，上2ul跑电泳，结果降解，只有一条带，测OD值很好，跟那个天净沙的试剂盒一样；跑电泳什么的都没问题的，因为全是新配的，且同一块胶里茎能跑出3条带来，它则在5S处有一条带，现在正打算换一种方法，不知这位朋友有无好的方法推荐？
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4楼2013-09-27 14:15:25
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一池荷

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liutong1026 at 2013-09-27 21:34:04
我们也在提木本的RNA，用百泰克的盒子，师兄取老木头用电钻钻取，然后马上装离心管丢液氮里，细点的枝条用转笔刀取，提的还不错来，，，提RNA关键就是取样快

现在我木本茎已经提好了，质量也不错，3条带很完整，就是有DNA污染，倒是叶子不好提，很容易褐化，老是提了就一条5S带，请问你们有无好的方法推荐啊？
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6楼2013-09-29 13:28:39
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liutong1026

铜虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by 一池荷 at 2013-09-29 13:28:39
现在我木本茎已经提好了，质量也不错，3条带很完整，就是有DNA污染，倒是叶子不好提，很容易褐化，老是提了就一条5S带，请问你们有无好的方法推荐啊？...

叶片按道理会好提些，传统方法应该也能提出了，容易褐化的话就哨多加点巯基乙醇
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7楼2013-10-03 23:27:25
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一池荷

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liutong1026 at 2013-10-03 23:27:25
叶片按道理会好提些，传统方法应该也能提出了，容易褐化的话就哨多加点巯基乙醇...

我也认为叶片会好提一些的，用提茎的方法提叶就是不行，换了好几种方法了，已经。。。。
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8楼2013-10-05 21:15:07
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一池荷

铁虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by liutong1026 at 2013-09-27 21:34:04
我们也在提木本的RNA，用百泰克的盒子，师兄取老木头用电钻钻取，然后马上装离心管丢液氮里，细点的枝条用转笔刀取，提的还不错来，，，提RNA关键就是取样快

以前我师姐有用过百泰克的盒子提木本茎，她当时是提的不好，虽然植物不同，但我也没考虑再买了
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9楼2013-10-16 19:54:25
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