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关天T载体中蓝白斑的问题
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本人最近做T载体实验，做了几次都没有成功，现和各位大侠交流求教。 最近一次的实验困扰: 细菌复苏后分别铺菌和摇菌----铺菌出现白斑和蓝斑，白斑大于５０% ----摇菌菌液也变浑浊了。 下一步：挑白斑划线----划了三个平板，均无细菌生长 分析：挑白斑少了。白斑太小 下一步：从冰箱取出再培养了４小时（蓝白斑平板） 挑白斑划线----一次取二到５个白斑划一个平板，共计划三个平板 结果还是无细菌生长，有一个全是蓝斑 分析：挑菌时有可能挑到蓝斑，对摇菌试管进行细菌扩增。 下一步：对摇菌试管取10ul加2mlLB+2ulAMP进行再摇菌扩增 下一步：对摇菌试管和扩增的试管各取100ul用煮沸法用目的片段的引物 PCR进行验证，电泳加目的DNA作阳性对照和Maker,结果有和阳性对照一样 的条带。 下一步：对扩增的试管进行铺菌----分别10^3,2*10^3,4*10^3 的稀释倍数 三个平板，结果三个平板均是蓝斑，无白斑。 困扰的问题： １ 第一次有蓝白斑，为何划线分不出白斑？摇菌培养过，液体清亮。 ２ 验证有目的DNA片段的存在，后续铺菌中为何全是蓝斑？ 我的分析： １白斑可能是其它DNA片段污染---但是即使污染，划线也应该有白斑出现呀 ----有没有不含DNA片段的白斑呢？----按蓝白斑筛选的原理是不可能的呀 ２验证细菌中有目的DNA片段的存在，铺菌全是蓝斑，可能目的片段的细菌 含量太少，没有出现，----但是三个平板都没有白斑，可能性太小了 ３LB平板的配制有问题，我只想到出现了蓝斑那么X-GAL和IPTG应该没有问题， AMP是否有影响还不清楚。 请教各位有经验的朋友们帮我分析一下呀，我快被骂死了，做了这么久没有做出来 |
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yudaoqian88
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现在感觉最需要解决的问题是获取阳性克隆，而不是找原因，鉴于此，我感觉还是这样做比较好些： 1） 如果蓝斑菌液扩增结果显示阳性，且扩增大小与自己的目标基因大小一致（如果你扩增的产物长度是你目的基因全长的话，可以从长度上筛选），可以考虑送一两个样品直接测序，看序列是否为目标序列； 2） 还是用传统方法连接的话，最好再设计一对新的引物，可以在原来引物的外侧，特异性要高，作为备用引物，可能新引物效果会好些！ 3） 如果更换克隆方式，可以咨询老师同学，在别人的帮助下开展下步工作，边做边学习。 4） 考虑到因素太多，片段本身、试剂、操作细节等等都可能影响结果，所以最快捷的方式是把你的引物和模板给别的做的比较成功的朋友，并把你的程序和之前PCR产物电泳结果、凝胶回收结果的图片发给他做以参考，让别人重复，看是够有效果，至于现在遇到的问题，最好以后再细说； 小木虫有帖子说：实验一直做不顺，休息了三四天，做了个重复，出来结果了！好复杂！ |
7楼2013-09-17 08:11:16
yudaoqian88
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楼主逻辑好强，看的我最后有点小乱了，仅就最后一些个人感觉发表点小看法哈！ 1) 涂板有不长菌，应该抗生素是没有问题的。涂板后有蓝斑，表明X-GAL和IPTG也没有问题，应该不是试剂出了错； 2) 蓝白斑筛选过程是有假阳性情况出现的，即使长了白班，也不一定是自己的目标质粒。有可能是PCR非特异扩增小片段（电泳无法检测到）的连接产物，但这种情况，一般菌液PCR就可以检测到并排除； 3）蓝斑有时候可能会是目标产物，蓝白斑筛选应该是插入片段破坏了载体自身的读码框，如果片段不大，或者片段插入未能改变读码框，就很有可能出现蓝色阳性克隆。 4） 可以加长菌体在平板上的培养时间，让菌斑长大一点，同时加长菌板在冰箱的诱导时间，这样显色比较方便观察和排除。 暂时就这些吧，别的原因我也不大清楚，不过看楼主的意思，已经得到阳性克隆了，为何还要铺板子？直接送公司测序就好了；还有就是，画线培养就是为了纯化菌斑的，如果挑4-5个画个板子，有点绕圈子了！ 祝好，大家相互学习，共同进步！ |
2楼2013-09-14 14:06:27
cicelyzh
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