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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关天T载体中蓝白斑的问题
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下雨没有伞

银虫 (小有名气)

[求助] 关天T载体中蓝白斑的问题

本人最近做T载体实验，做了几次都没有成功，现和各位大侠交流求教。
最近一次的实验困扰:
细菌复苏后分别铺菌和摇菌----铺菌出现白斑和蓝斑，白斑大于５０%
　　　　　　　　　　　　----摇菌菌液也变浑浊了。
下一步：挑白斑划线----划了三个平板，均无细菌生长
分析：挑白斑少了。白斑太小
下一步：从冰箱取出再培养了４小时（蓝白斑平板）
挑白斑划线----一次取二到５个白斑划一个平板，共计划三个平板
结果还是无细菌生长，有一个全是蓝斑
分析：挑菌时有可能挑到蓝斑，对摇菌试管进行细菌扩增。
下一步：对摇菌试管取10ul加2mlLB+2ulAMP进行再摇菌扩增
下一步：对摇菌试管和扩增的试管各取100ul用煮沸法用目的片段的引物
PCR进行验证，电泳加目的DNA作阳性对照和Maker,结果有和阳性对照一样
的条带。
下一步：对扩增的试管进行铺菌----分别10^3,2*10^3,4*10^3的稀释倍数
三个平板，结果三个平板均是蓝斑，无白斑。
困扰的问题：
１　第一次有蓝白斑，为何划线分不出白斑？摇菌培养过，液体清亮。
２　验证有目的DNA片段的存在，后续铺菌中为何全是蓝斑？
我的分析：
１白斑可能是其它DNA片段污染---但是即使污染，划线也应该有白斑出现呀
----有没有不含DNA片段的白斑呢？----按蓝白斑筛选的原理是不可能的呀
２验证细菌中有目的DNA片段的存在，铺菌全是蓝斑，可能目的片段的细菌
含量太少，没有出现，----但是三个平板都没有白斑，可能性太小了
３LB平板的配制有问题，我只想到出现了蓝斑那么X-GAL和IPTG应该没有问题，
　AMP是否有影响还不清楚。
请教各位有经验的朋友们帮我分析一下呀，我快被骂死了，做了这么久没有做出来
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只有向往美好的生活，才能过上美好的生活
1楼2013-09-14 11:07:35
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下雨没有伞

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-09-14 22:49:54
有些混乱。蓝白斑筛选是有假阳性的可能。所以需要挑白斑再进一步鉴定。你说挑白斑再次划线后不长是什么意思？你的板不是同时做的吗？为什么初始的平板长菌而再次划线的不长？配置平板时的LB没有错的话，amp注意要等 ...

我最不能理解的就在这，挑白斑再次划线后没有细菌生长。是同一批做的板子。不知道怎么会有这种情况发生。这是一个矛盾的结果，但事实却是这样的，不知道你有没有遇到过这种情况。我的AMP添加温度可能有点高了，手摸有点烫。
目前我还在做这个，正在继续找原因，希望能和你交流下经验，指导一下。
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只有向往美好的生活，才能过上美好的生活
4楼2013-09-16 17:17:49
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+6, 鼓励回帖交流！ 2013-09-14 16:04:17
下雨没有伞: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-01-03 08:39:48
楼主逻辑好强，看的我最后有点小乱了，仅就最后一些个人感觉发表点小看法哈！
1) 涂板有不长菌，应该抗生素是没有问题的。涂板后有蓝斑，表明X-GAL和IPTG也没有问题，应该不是试剂出了错；
2) 蓝白斑筛选过程是有假阳性情况出现的，即使长了白班，也不一定是自己的目标质粒。有可能是PCR非特异扩增小片段（电泳无法检测到）的连接产物，但这种情况，一般菌液PCR就可以检测到并排除；
3）蓝斑有时候可能会是目标产物，蓝白斑筛选应该是插入片段破坏了载体自身的读码框，如果片段不大，或者片段插入未能改变读码框，就很有可能出现蓝色阳性克隆。
4） 可以加长菌体在平板上的培养时间，让菌斑长大一点，同时加长菌板在冰箱的诱导时间，这样显色比较方便观察和排除。
暂时就这些吧，别的原因我也不大清楚，不过看楼主的意思，已经得到阳性克隆了，为何还要铺板子？直接送公司测序就好了；还有就是，画线培养就是为了纯化菌斑的，如果挑4-5个画个板子，有点绕圈子了！
祝好，大家相互学习，共同进步！
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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
2楼2013-09-14 14:06:27
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-09-24 10:45:16
有些混乱。蓝白斑筛选是有假阳性的可能。所以需要挑白斑再进一步鉴定。你说挑白斑再次划线后不长是什么意思？你的板不是同时做的吗？为什么初始的平板长菌而再次划线的不长？配置平板时的LB没有错的话，amp注意要等培养基冷却至45-50°C后再添加。
挑菌不可能少吧，一个克隆里是一个细菌经N次繁殖后的总和。理论上说一个细菌都可以长的。
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3楼2013-09-14 22:49:54
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下雨没有伞

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yudaoqian88 at 2013-09-14 14:06:27
楼主逻辑好强，看的我最后有点小乱了，仅就最后一些个人感觉发表点小看法哈！
1) 涂板有不长菌，应该抗生素是没有问题的。涂板后有蓝斑，表明X-GAL和IPTG也没有问题，应该不是试剂出了错；
2) 蓝白斑筛选过程是有 ...

首先感谢你提供的经验和线索---蓝斑也可能是目标产物。
我还没有找到阳性克隆，只是PCR验证了菌液里面有阳性克隆。
我现在是要提纯阳性克隆。如果它是蓝斑的话，我就没有办法了。
我在继续做这一次的实验，彻底证实了失败以后我再放弃。
挑４-５个的原因：是因为前一次挑单克隆没有细菌生长。
　　　　　　　　我分析：是不是我挑的几个单克隆有问题呢？为了验证我的想法，我挑了４-５个划平板，又挑了几个单克隆摇菌。结果都没有细菌生长。

为什么白斑不长菌，这是我最想不通的地方？


希望多和你交流学习指导一下。
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只有向往美好的生活，才能过上美好的生活
5楼2013-09-16 17:38:35
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