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紫眸玉儿

木虫 (小有名气)

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虫号: 1380108
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专业: 生物化学

[求助] 连接老连不上，求指导

最近，本来挺简单的连接老出问题，自己也试了很多次。
实验目标：将一个载体上启动子替换成另外的启动子，用的酶切位点是DraIII,扩增所需启动子的引物上有该酶切位点，还加上保护碱基GGG,上游引物为5'GGGCACGGGGTGAGGGAACAAAAGCTGGGTAC3' ；下游为5'GGGCACTTTGTGAATCCATGCTAGAGTCCC3'，扩增后酶切回收，再与相应的载体连接；连接体系载体和产物的浓度都很高，之前也试过很多体系，都不行，求指导！

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1楼2013-09-08 19:55:06

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紫眸玉儿

木虫 (小有名气)

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引用回帖:

11楼: Originally posted by lliu at 2013-09-10 01:21:34
DraIII产生的是最好用的酶切位点，因为是定向连接，而且没有多聚体（单向连接），故连接效率极高。这个酶我几乎天天在用。

如果确认该酶没有失活，而且载体和PCR中没有多余的切点，两个事情要主要一下。

1，D ...

多谢指导

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