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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » phosphate Bad western 检测的条件
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qiannv04

新虫 (初入文坛)

[求助] phosphate Bad western 检测的条件

如题啊，由于Bad蛋白比较小，只有23KDa，磷酸化形式的更是很难检测，我用的转膜条件为定流，350mA，30min，酪蛋白封闭2h,一抗4℃过夜。但还是不行，求助高手指点啊，多谢啦~~
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1楼 2013-09-02 23:38:26
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qiannv04

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 514278815 at 2013-09-04 07:57:38
你验证转膜是否问题了吗？，如没有验证，可以用丽春红预染看看是否转膜成功。

转膜没有问题的，因为我同时还检测了其他的分子，可以正常的发出条带。还可能是什么原因呢？您在发这种小分子量而且可能低丰度的蛋白时的条件是什么样子的呢？
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5楼2013-09-04 21:25:09
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-09-03 13:13:12
不知道这蛋白,但是有一点问题: 你的抗体是测磷酸化的吗?
如果是的话,最好别用酪蛋白做封闭,用BSA做封闭,因为酪蛋白含有大量磷酸化形式的蛋白,背景很高
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2013-09-03 01:03:37
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qiannv04

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2013-09-03 01:03:37
不知道这蛋白,但是有一点问题: 你的抗体是测磷酸化的吗?
如果是的话,最好别用酪蛋白做封闭,用BSA做封闭,因为酪蛋白含有大量磷酸化形式的蛋白,背景很高

谢谢你的建议，也有人建议我不要用酪蛋白封闭。但是我发其他磷酸化的蛋白也用酪蛋白封闭，没有问题，所以应该不单是封闭液的问题。
我的最主要的困境是根本发不出条带。。。
Bad是Bcl2家族中抗凋亡类别中的一员。
再次谢谢你的解答。
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3楼2013-09-03 23:39:51
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514278815

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你验证转膜是否问题了吗？，如没有验证，可以用丽春红预染看看是否转膜成功。
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4楼2013-09-04 07:57:38
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