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jiangcheng14

金虫 (小有名气)

[求助] 什么实验可以验证一个蛋白对dna的nicking作用

纯化了一个蛋白，怎样做实验看它有没有对dna的nicking作用
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1楼 2013-08-23 16:57:40
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凌波丽

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jiangcheng14(kx444555代发): 金币+20, 鼓励交流 2013-09-20 20:21:26
jiangcheng14: 金币+80 2013-10-29 15:58:40
　　　如果某种蛋白质与DNA片段相互作用并可能参与DNA的单链修复，你可以分几步来做(我尽量选择技术和设备要求低的实验方案，各部分的序号不是随机排列，代表了实验的流程顺序）：
　　　确定这一蛋白质的相对分子量，用质谱很容易测定，用SDS-PAGE电泳也可以。想必在分离提纯时已经获得了目的蛋白质的相对分子量。
　　　确定目的蛋白质一级结构，可以用胰蛋白酶对其有限水解，然后分别对水解片段用质谱测定相对分子量，然后到蛋白质组的有关数据库中搜索出对应的蛋白质，以此获得目的蛋白质一级结构的信息和基因的编码信息，如果幸运的话，还可以获得目的蛋白质二级结构和三级结构的信息；如果在蛋白质组的有关数据库中搜索不到对应的蛋白质，那么说明这是一个全新的蛋白质，必须对其进行从头测序，用全自动测序仪即可，可以本实验室测定，也可以送交有条件的生物技术公司，确定目的蛋白质一级结构已经信息提交国际蛋白质数据库。无论如何，确定目的蛋白质一级结构都是发表论文所必需的。
　　　确定目的蛋白质的细胞定位，方法很多，下面说三种方法为例。
　　　（1）以共表达的目的蛋白质-荧光蛋白质融合蛋白质确定目的蛋白质的细胞定位。如果能够确定目的蛋白质一级结构的信息和基因的编码信息，接着用GFP、YFP的基因和目的蛋白质的基因以融合蛋白质方式导入质粒载体，并且导入细胞，筛选阳性克隆，大规模培养阳性克隆，在细胞中以目的蛋白质-GFP或YFP融合蛋白质表达，最后后在外加光源激发的情况下，用荧光显微镜观测以确定目的蛋白质-GFP或YFP融合蛋白的具体的细胞定位位点。如果不能从现有的蛋白质数据库中知道的蛋白质一级结构的信息和基因的编码信息，单凭自动测序仪测定的全新的目的蛋白质的一级结构的信息，想获得其全部基因的编码也不是很容易，而且知道了想克隆出来也要费一些功夫。
　　　（2）直接从细胞成分的分级分离确定目的蛋白质的细胞定位。我们即使知道了目的蛋白质一级结构的信息和基因的编码信息也没有必要使用基因的编码信息和GFP等，只要根据提取目的蛋白质时的该种蛋白质在细胞不同部位的丰度即可。目的蛋白质与DNA片段相互作用并可能参与DNA的单链修复，那么当然在细胞核里应该有，但是可能有细胞周期有关，所以可以在细胞周期的不同分布时期粉碎细胞，分级分离提纯细胞核，而后粉碎细胞核后获得确定目的蛋白质，这样也就证实了目的蛋白质的细胞定位。
　　　（3）显微注射有荧光标记的抗体确定目的蛋白质的细胞定位。不知道目的蛋白质的基因也可以制备出目的蛋白质的抗体，将分离提纯出来的蛋白质注射入家兔的体内（可以加入免疫佐剂），数月后收获抗体，分离纯化抗体，不必是单克隆抗体，多克隆抗体即可。然后用荧光有机小分分子标记抗体（两者共价连接），再用显微注射法导入到含有目的蛋白质的细胞，再用荧光显微镜观测，也可以确定目的蛋白质的细胞定位。
　　　相比较而言，当然是直接从细胞成分的分级分离获得目的蛋白质的细胞定位最方便。
　　　4.确定目的蛋白质的进入细胞核的途径，如果需要的话。
　　　做这步实验就需要确定目的蛋白质一级结构的信息和基因的编码信息，如果能够确定目的蛋白质一级结构的信息和基因的编码信息，接着用GFP、YFP的基因和目的蛋白质的基因以融合蛋白质方式导入质粒载体，并且导入细胞，筛选阳性克隆，大规模培养阳性克隆，在细胞中以目的蛋白质-GFP或YFP融合蛋白质表达，最后后在外加光源激发的情况下，用荧光显微镜观测以确定目的蛋白质-GFP或YFP融合蛋白的具体的进入细胞核的途径，可以对于活细胞进行动态观测。不过如此实验实在是比较麻烦，如果不需要确定目的蛋白质的进入细胞核的途径，这一步就不要做了，即使要做，这一步与下面的实验也没有承接关系，可以平行进行。
　　　直接用电子显微镜观测效果不好，因为不好确定何时何种条件下，目的蛋白质会恰好进入细胞核，即使观察到蛋白质会恰好进入细胞核，如何确定某个蛋白质就是目的蛋白质也不很容易。
　　　确定目的蛋白质与DNA片段能够相互作用，并确定目的蛋白质特异性结合到DNA片段上的特异性序列。
    DNA-Protein interaction的研究技术方法多了去了！电子显微镜直接观测、NMR、DNA-Protein共结晶后X-ray diffraction、能量转移、足迹法、干扰法、光活化的特异性位点的DNA-Protein交联反应、原子力显微镜液相直接观测、全内放射光学显微镜观测等，你具体可以参考：·Tom Moss and Benoit Leblanc edit,DNA-Protein Interaction-----Principles and Protocols,Huamna Press,2009.下面仅举三例以作说明。
    （1）ChIP-chip。ChIP当然是很直接的试验方法，你们实验室也都做不了，那么就用足迹法吧。能够使用ChIP芯片当然就更好了，不过估计绝大数实验室目前没有这个条件。足迹法实际上还是细胞外方法，虽然足迹法是细胞外方法，但是总可以确定该目的蛋白质是与特定片段的DNA序列特异性结合的，并且找出具体结合的DNA片段。凝胶状阻滞电泳也可以。
　　　免疫沉淀（用类似免疫共沉淀的方法），但是不一定会成功。如果你能够确定细胞大致在什么条件下会有目的蛋白质结合于DNA片段上可能参与DNA修复，那么也可以用类似免疫共沉淀的方法获得DNA-目的蛋白质复合物，此时粉碎，在细胞提取液放入抗目蛋白质的抗体（单抗或者多抗），搅拌均匀，然后加入共价连接有琼脂糖磁珠的Protein A或Protein G，Protein A或Protein G会与抗目蛋白质的抗体（单抗或者多抗）专一性结合，后者又会与目蛋白质专一性结合，目的蛋白质则会与DNA片段结合，这样目的蛋白质-DNA复合物（同时连接着抗就被钓出来了，然后用离心方法很溶液获得蛋白质-DNA复合物，但是这时目的蛋白质-DNA-抗目的蛋白质的抗体三元复合物很可能还非共价地连接着和共价连接有琼脂糖磁珠的Protein A或Protein G，即次级键连接的四元复合物。如果能够用一些分梯度的表面活性剂或者变性剂可能获得蛋白质-DNA复合物而把其他的成分分离下去，然后再用足迹法可以确定目的蛋白质结合DNA的具体序列。但是这样很难成功，这一实验方案不一定能成功。那木应该如何得到四元复合物中的目的蛋白质则会与DNA片段结合的复合物，而去掉四元复合物中的其他的成分。最直接的办法，模仿ChIP,只在在细胞外进行，离心分离到 目的蛋白质-DNA-抗目的蛋白质的抗体-共价连接有琼脂糖磁珠的Protein A或Protein G，即次级键连接的四元复合物后，加入甲醛，形成DNA-目的蛋白质 cross linking complex，也就是把最为邻近DNA的蛋白质与DNA的非共价作用变为共价键连接。当然，甲醛也有可能在抗目的蛋白质的抗体-共价连接有琼脂糖磁珠的Protein A或Protein G之间也可能构成cross linking，甚至把目的蛋白质-DNA-抗目的蛋白质的抗体-共价连接有琼脂糖磁珠的Protein A或Protein G四者通过DNA-Protein形成cross linking complex，如此也不难，只要走一下分子筛层析就行了，实在不知道分子筛层析哪个洗脱峰的归属，用质谱测一下分子量。DNA的分子量不好确定，那么在用甲醛之前可以用限制性内切酶充分切割DNA，让留下的DNA片段尽量短些，再结合目的蛋白质、抗体和琼脂糖磁珠的Protein A或Protein G的红外光谱特征与相对分子量，并不难确定分子筛层析各个洗脱峰的归属。当然如此操作还是不上算。所以接看下面的实验方案。
   （3）亲和层析。更直接和更简单的的实验方法是将目的蛋白质共价结合到葡聚糖层析柱的介质上，然后用含有目的蛋白质的细胞的总DNA过葡聚糖层析柱，再洗脱下来，即可得到与目的蛋白质专一性结合的DNA。
　　　但是也有可能在不执行DNA修复时，目的蛋白质完全没有专一性结合上DNA，这是就必须要人为制造出一些有缺陷的DNA片段，然后加入目的蛋白质，用凝胶阻滞电泳加以比较，然后用足迹法确定具体结合位点。体外实验时最好加入细胞核提取液，除去DNA。
　　　确定目的蛋白质与DNA片段能够相互作用，并且参与了DNA单链的修复。可以用细胞外实验，即用PCR引入突变或者PCR扩增DNA后使用产生修饰的化学试剂等方法产生有非正常的DNA双链，而后加入目的蛋白质和ATP、GTP，充分混合，并且加入目的蛋白质所在的细胞核的提取液（除去DNA和组蛋白），然后过一段时间后提取非正常的DNA双链加以测序,目的蛋白质的确能够起到修复作用的话，那么其可能与DNA修复有关。
    使用RNAi,knock in,knock out等抑制或去除目的蛋白质在细胞中的表达的方法也可以，但是首先需要了解如何检测特定的DNA修复过程缺失所产生的表型变化，而且需要能够游离培养含有目的蛋白质的细胞。如果要对实验动物做整体动物水平的检测特定的DNA修复过程缺失所产生的表型变化，那要从胚胎干细胞做起，工作量太大了。
　　　确定目的蛋白质受到哪些细胞信号的调控，这包括确定细胞信号传导途径和目的蛋白质受到的具体的基因表达调控或/和目的蛋白质对于具体的基因表达调控的影响。这个题目就很大了，我不想叙述了。
　　　如果要解析目的蛋白质与DNA片段的相互作用的精细结构，那么除了低温冷冻电子显微镜、X-ray diffraction 解析目的蛋白质与DNA片段的相互作用的单晶体精细结构（如果能够形成共结晶的单晶体的话）、NMR（需要在细胞生物合成目的蛋白质之前加入自旋量子数不为零的元素标记物的氨基酸，并且使其掺入到目的蛋白质，而且目的蛋白质分子量小于40KD），毫无疑问，一般而言，第8步没有必要在做了。
    楼主给出的信息太少了，我只能说这些，而且说的内容已经太多了，有3500+字。
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10楼2013-09-02 23:08:40
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凌波丽

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kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-09-20 20:21:14
我已经想好了试验方法，有很多种。我需要楼主先回答一些问题，以便对于试验方法有所选择。
1.该蛋白质的识别DNA双链是否有已知的DNA的二级结构或者一级结构信息，或者是否有同源蛋白的识别DNA双链是否有已知的DNA的二级结构或者一级结构信息作为参考？
2.目的蛋白质的基因是否知道？或者是否有同源蛋白的基因已经获知？
3.目的蛋白质切割某一段DNA的双链序列的一条链上切出一个缺口是仅切割不连接？还是既切又连？
4.目的蛋白质的一级结构是否已知？
5.目的蛋白质是否含有任何已知的辅基或者辅酶或者金属离子？
6.目的蛋白质在不切割一段DNA的双链序列的一条链时是否与DNA非共价结合？
7.是否已知可能存在的目的蛋白质的非共价结合的调控蛋白质？
8.目的蛋白质的细胞定位是否已知？

这些问题实际上都可能包含在我提供的protocols中，如果楼主希望我提供的protocols有具体的参考价值，请回答以上问题。对于以上问题没有答案也是一种的有效的答案，对于选择protocols仍然是有帮助的。
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5楼2013-08-26 22:31:13
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凌波丽

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那就按照你给出的这点信息给你设计参考实验方案。
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9楼2013-08-27 12:13:23
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

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感谢参与，应助指数 +1
试验方法有很多种，但是我要知道：你说的nicking具体指什么？要达到什么程度？
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2楼2013-08-23 23:12:56
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jiangcheng14

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-08-23 23:12:56
试验方法有很多种，但是我要知道：你说的nicking具体指什么？要达到什么程度？

我想看看它会不会在某一段双链序列的一条链上切出一个缺口
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3楼2013-08-24 11:13:54
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

我已经大致有了试验流程的设计方案，晚些时间回答你。
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4楼2013-08-24 20:28:37
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
9.目的蛋白质切割某一段DNA的双链序列的一条链上切出一个缺口是否耗能？有没有ATP，GTP之类的供能物质小分子？
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6楼2013-08-26 23:05:28
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jiangcheng14

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-08-26 22:31:13
我已经想好了试验方法，有很多种。我需要楼主先回答一些问题，以便对于试验方法有所选择。
1.该蛋白质的识别DNA双链是否有已知的DNA的二级结构或者一级结构信息，或者是否有同源蛋白的识别DNA双链是否有已知的DNA的 ...

只是猜测该蛋白可能有这种功能，与他同源的蛋白都是与DNA修复有关的蛋白，如sbcc蛋白，位点猜测可能是在GG之间，至于切割位点附近是否有二级结构或者别的一级结构信息还不清楚，不知道这个情况怎么做
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7楼2013-08-27 08:40:29
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jiangcheng14

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-08-26 23:05:28
9.目的蛋白质切割某一段DNA的双链序列的一条链上切出一个缺口是否耗能？有没有ATP，GTP之类的供能物质小分子？

可能需要吧 我觉得
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8楼2013-08-27 08:41:26
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