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求高手指点迷津，关于植物亚细胞组分的分离
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求高手指点迷津，关于植物亚细胞组分的分离 RT.最近在做植物对重金属胁迫响应的实验，需要对叶片亚细胞组分进行分离，查了一些文献，对其中某些条件有些疑问，望大侠可以指点一下，如下： （一）在百度文库里和老师给的文档里给出的条件： 0.2000g鲜样加入提取液8mL[0.25mol/L蔗糖+50mmol/LTris-HCl缓冲液（pH=7.5）+1mmol/L二硫赤鲜糖醇]，研磨匀浆，倒入10mL离心管进行离心，统一在4摄氏度下进行。 1.300g/min*30s，沉淀为细胞壁以及未研碎的细胞（F1） 2.取上步上清液 2000g/min*15min 沉淀为细胞核和叶绿体组分（F2） 3.取上步上清液 10000g/min*20min 沉淀为线粒体组分（F3） 上清液为含核糖体的可溶性组分（F4） （二）在文献中查出的条件 10g鲜样加入提取液100mL0.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH=7.0），研磨匀浆，进行离心，统一在4摄氏度下进行。样品与提取液比例为1：10 1.200g/min*10min，沉淀为细胞壁以及未研碎的细胞（F1） 2.取上步上清液 600g/min*10min 沉淀为细胞核和叶绿体组分（F2） 3.取上步上清液 10000g/min*30min 沉淀为线粒体组分（F3） 上清液为含核糖体的可溶性组分（F4） 两种提取条件中存在的差异如何选择： a.样品与提取液的比例多少合适？ b.提取液成分主体为Tris-HCl缓冲液，加入0.25mol/L蔗糖是为了保持渗透压，防止叶绿体的破裂，个人认为这个很有必要添加，但有的人提出蔗糖浓度为0.4mol/L；还有二硫赤鲜糖醇是否有必要添加？ c.两种条件里叶绿体的沉淀离心条件不同，哪一种比较合理？ d.第二三步离心的时间如何确定比较合适？ 敬请各位大侠指点 |
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