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本人做的是骨骼肌组织，目的是观察核形态，确定死亡方式 要求回答者提供下列资料： 1.详细步骤 2.需要购买的试剂 3.注意事项以及实验个人心得 [ Last edited by meizhou on 2007-11-8 at 16:11 ] |
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冷冻组织的来源：1）新鲜组织；2）甲醛固定过的组织；3）原来冷冻储存的组织。取出的组织标本应该尽量减少其含水量。 大小：2.5cm×1.5cm×0.3cm 方案1：全过程10min 切片后固定 新鲜组织取材 立即置入超低温冰箱/液氮冷冻2min (锡箔纸包裹后冷冻，用于组织的保存) 用OCT包埋在冰冻头子上，切片0.5～30微米 风干/固定 冷丙酮固定/乙醚酒精混合液固定(乙醚、95%酒精等量混合) 1min 染色: 切片水洗10S→入苏木素2min→水洗10S→1%盐酸分化10S→水洗30S→置入促蓝液蓝化1min→水洗10S→伊红染色30S→脱水30S，2次→透明1min→封固。（促蓝液:碳酸钠3.5g、硫酸镁20g、蒸馏水2000ml） 方案2： 切片前固定 新鲜组织取材后， 4%甲醛固定固定2h或以上 入15%、20%、30%蔗糖溶液（0.1M PBS，pH7.4），浸泡至组织块沉底 冰冻切片机切片， 贴片，风干，-20度保存备用 染色：切片水洗→入苏木素2min→水洗→1%盐酸分化→水洗→置入促蓝液蓝化1min→水洗→伊红染色→脱水→透明→封固。 |
11楼2007-11-08 15:42:08
边疆小鱼
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所有内容已发到你邮箱,若有不明白之处,可以联系我. 每个步骤都要严格操作,尤其是时间,一定要定好,不然就会影响后面的切片及染色. 骨骼肌,相对来说比较容易, 以下是我自己做切片选择的试剂: 固定剂:甲醛:水(1:20) 脱水:50%乙醇--12小时 70%乙醇--12小时 85%乙醇---4小时 95%乙醇----2.30小时 无水乙醇---2小时 透明:二甲苯一(30分钟 二甲苯二(30分钟) 浸蜡与包埋:温度60度以下.具体操作请看邮件. 切片前,最好将做好的蜡块冷藏一下,切出来的片在比较容易展开. 切片的要点就是,要调整好蜡块,让整个面都被切到. 展开,我采用的是30%乙醇,切片时,将载波片置于加热器上,40度左右,滴30%乙醇于玻片,将切好的蜡片展到玻片即可. [ Last edited by 边疆小鱼 on 2007-11-7 at 19:03 ] |
2楼2007-11-07 18:38:10
3楼2007-11-07 19:13:14
边疆小鱼
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接上面 做好切片,放入烘箱使组织更好的固定在玻片,时间最好大于5小时. 染色步骤: 从烘箱取出切片,乘热依次放入: 二甲苯一(20分钟), 二甲苯二(20分钟), 无水乙醇(3-5分钟), 95%乙醇(3-5分钟), 85%乙醇(3-5分钟), 70%乙醇(3-5分钟) 以上步骤为脱蜡 水洗3-5分钟 苏木素(15分钟) 水洗一分钟 盐酸-酒精,小于30秒(注意,此段时间一定要控制好,时间太短,分化不完全,太长,细胞核的颜色也会褪去. 流水中冲洗40分钟,使细胞核的颜色返蓝. 95%乙醇一分钟. 伊红染色5分钟, 水洗一分钟,至颜色合适 晾干后,中性树胶封片. [ Last edited by 边疆小鱼 on 2007-11-7 at 19:23 ] |
4楼2007-11-07 19:18:51