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liushuizhf

铁虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白变性

本人在做蛋白纯化，蛋白C端加有6个His标签，N端加有信号肽，目的蛋白分泌到发酵液里，现在一直纯化不到目的蛋白，怀疑是不是His标签被包裹在蛋白里，想通过蛋白变性以达到纯化的目的，100℃煮发酵液可不可以啊，谁做过相关内容，请赐教啊！
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1楼 2013-07-30 10:49:53
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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liushuizhf(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-30 15:55:53
liushuizhf: 金币+2 2013-10-08 08:44:12
感觉楼主刚刚开始做纯化吧，肯定不能100度煮的啊。。。。你的发酵液是大肠吗还是酵母？？你应该吧分离下破碎的细胞上清和沉淀先看一下蛋白到底在哪里啊~也有可能根本没有表达呢
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我会绕一个圈，走回到实验室
2楼2013-07-30 12:58:23
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xz2001199802

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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liushuizhf(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-30 15:56:00
liushuizhf: 金币+2 2013-10-08 08:44:26
你的纯化目的是什么，如果下步是测酶活的话，你煮了，酶不是都挂掉了。你确定是分泌到发酵液中，你应该先SDS-PAGE一下，甚至westernblot，确定有表达，然后确定在哪里
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越学越无知
3楼2013-07-30 13:59:54
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liushuizhf

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by loveskyzhou at 2013-07-30 12:58:23
感觉楼主刚刚开始做纯化吧，肯定不能100度煮的啊。。。。你的发酵液是大肠吗还是酵母？？你应该吧分离下破碎的细胞上清和沉淀先看一下蛋白到底在哪里啊~也有可能根本没有表达呢

恩，是的，我做的的发酵液是黑曲霉的发酵液，蛋白不确定就一定分泌到发酵液了，但是破碎的细胞上清和沉淀都没有明显目的条带，发酵液有疑似目的条带，但一直纯化不到，我的蛋白不需要活性，但容易降解，所以想按照变性蛋白的条件做一遍，不知道有什么好的方法没可以使蛋白变性？
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4楼2013-07-30 14:03:37
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
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我会绕一个圈，走回到实验室
5楼2013-07-31 08:32:59
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liushuizhf

铁虫 (初入文坛)
内容已删除
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6楼2013-07-31 13:08:43
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草蔻年华

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-07-31 14:11:51
liushuizhf: 金币+2 2013-10-08 08:45:05
还真没碰到过蛋白会分泌到体外的情况。。跑蛋白电泳的时候发酵液的上样量是多少？条带明显不明显？用盐酸胍可以变性，但是不是简单的加入进去就行。是要一定浓度的。而且不仅仅是盐酸胍还需要加别的钠盐。另外尿素是在后面让蛋白梯度复性的时候用到的，有用尿素来变性的吗？这点不是很清楚。
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7楼2013-07-31 13:57:57
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
liushuizhf: 金币+2 2013-10-08 08:45:21
引用回帖:
6楼: Originally posted by liushuizhf at 2013-07-31 13:08:43
我的纯化方法就是用镍柱纯化，目的蛋白上的His标签与镍柱上的镍结合，用咪唑梯度将目的蛋白洗脱下来，现在怀疑目的蛋白上的His标签被包裹在蛋白里，没法与镍柱结合，所以想使蛋白变性，使His标签裸露出来，从而得到 ...

当然不是啊，要破菌后加变性剂的。这个一两句很难讲清，你看看这个应该就会了，最好找人手把手教你，否则就要多试几次了。加油吧
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我会绕一个圈，走回到实验室
8楼2013-07-31 17:11:17
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929519755

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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liushuizhf: 金币+2 2013-10-08 08:45:27
你要让那个蛋白变性的话，就在你纯化那个蛋白的溶液里面都加8M尿素，变性时间过夜就行了。不知道你那个是干什么的……
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想你没话说
9楼2013-07-31 17:28:19
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小黑L小白

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liushuizhf at 2013-07-30 14:03:37
恩，是的，我做的的发酵液是黑曲霉的发酵液，蛋白不确定就一定分泌到发酵液了，但是破碎的细胞上清和沉淀都没有明显目的条带，发酵液有疑似目的条带，但一直纯化不到，我的蛋白不需要活性，但容易降解，所以想按照 ...

一般的蛋白变性加变性Buffer后沸水煮5min后即可，如果蛋白以包涵体的形式表达，需要用4 －6 M 盐酸胍、4-8 M 脲、或强去污剂，将蛋白从包含体中溶解（和去折叠）。
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10楼2013-09-23 15:16:23
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