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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 测序测不出来，求大侠帮忙，急急。。。
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雪空凌

银虫 (初入文坛)

[求助] 测序测不出来，求大侠帮忙，急急。。。

我的载体是cosmid载体，插入片段是30-40kb 插入片段可能有重复区，但我的引物是在非重复区设计的，250bp左右，质粒浓度大概是100ng/ul， 做pcr可以有条带，测序是正确的，可用上下游引物双向测序，送了两个公司都说没信号，测不出来，这种情况是什么原因呢，有没有人测过这种情况知道哪家公司可以测出来，我改怎样解决，着急毕业，求好心人帮忙。。。
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在最困难的时候就是最接近成功的时候，不可以放弃
1楼2013-07-26 10:41:39
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
雪空凌: 金币+5 2013-07-26 11:25:29
首先你说上下游引物双向测序是要分开的呵，上下游引物不能混一起，要单独。
根据你的情况，问题应该在于你的质粒太小，浓度太低。所以导致测序没信号。
要找有经验的测序公司，跟他们技术沟通。提取高浓度的质粒。
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伟大航线....
2楼2013-07-26 10:50:54
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雪空凌

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by longrna at 2013-07-26 10:50:54
首先你说上下游引物双向测序是要分开的呵，上下游引物不能混一起，要单独。
根据你的情况，问题应该在于你的质粒太小，浓度太低。所以导致测序没信号。
要找有经验的测序公司，跟他们技术沟通。提取高浓度的质粒。

质粒太小吗？
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在最困难的时候就是最接近成功的时候，不可以放弃
3楼2013-07-26 11:28:10
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雪空凌

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by longrna at 2013-07-26 10:50:54
首先你说上下游引物双向测序是要分开的呵，上下游引物不能混一起，要单独。
根据你的情况，问题应该在于你的质粒太小，浓度太低。所以导致测序没信号。
要找有经验的测序公司，跟他们技术沟通。提取高浓度的质粒。

我直接提出来的质粒浓度只有20ng/ul，后来我把质粒用冷冻干燥机浓缩了，送去测序，这样做可以吗
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在最困难的时候就是最接近成功的时候，不可以放弃
4楼2013-07-26 11:42:35
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longrna

新虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-26 12:51:17
引用回帖:
3楼: Originally posted by 雪空凌 at 2013-07-26 11:28:10
质粒太小吗？...

不好意思，写错，应该是质粒太大。
测序反应是这样的，固定体积（如10ul），里面要包含dNTP buffer 酶，引物，以及模板）如果你模板质粒太大，则相应要多加一些模板，故要求浓度高一些，否则浓度太低会超出体积。
另外，测序反应是一个引物的，本来扩增效率就不是很高，再加上你的模板（质粒太大）那就更难扩了，所以测出来没信号。
尽量浓...最好跟测序公司技术沟通。
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伟大航线....
5楼2013-07-26 12:11:18
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
的确如二楼所说，质粒太大了，然后又浓度太低，你可以做个中抽然后送测序，不知道你用的是什么cosmid载体？
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2013-07-26 12:54:39
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雪空凌

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-26 12:54:39
的确如二楼所说，质粒太大了，然后又浓度太低，你可以做个中抽然后送测序，不知道你用的是什么cosmid载体？

pccfos2 载体，请问中抽是什么意思呢？
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在最困难的时候就是最接近成功的时候，不可以放弃
7楼2013-07-26 14:05:04
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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引用回帖:
7楼: Originally posted by 雪空凌 at 2013-07-26 14:05:04
pccfos2 载体，请问中抽是什么意思呢？...

质粒有小抽试剂盒，这个抽的量比较小，也有个中抽，大抽试剂盒，大抽比较麻烦，中抽就是介于小抽与大抽之间，有专门的kit，起始菌量可以大些，柱子的吸附容量也很大，如果想质粒浓度高些，可以适当缩小点洗脱体积
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
8楼2013-07-26 16:58:08
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雪空凌

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-26 16:58:08
质粒有小抽试剂盒，这个抽的量比较小，也有个中抽，大抽试剂盒，大抽比较麻烦，中抽就是介于小抽与大抽之间，有专门的kit，起始菌量可以大些，柱子的吸附容量也很大，如果想质粒浓度高些，可以适当缩小点洗脱体积...

en  明白了 谢谢
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在最困难的时候就是最接近成功的时候，不可以放弃
9楼2013-07-26 18:55:42
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冰风颤木

金虫 (正式写手)
你单独测试试 只用一条引物 沿着一个方向测序 不要双向侧
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船到桥头自然直
10楼2013-07-28 21:48:48
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