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summer沙

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白纯化

做蛋白纯化后跑电泳，出来过一次单条带，在和mark跑的时候居然没有目的大小的单条带，而是大分子量的单条带了。这很奇葩啊，不太想从头开始了，拜托各位大神指导指导啊！求原因，求分析啊！
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1楼 2013-07-25 21:46:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
分子量与理论值差多少？跑的是还原胶还是非还原胶？
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2楼2013-07-26 01:07:16
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summer沙

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 01:07:16
分子量与理论值差多少？跑的是还原胶还是非还原胶？

查了大概20KD左右，是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。之前出来过一次目的单条带，但是老师觉得是胶被拉长了，跑啊下来了，所以才会出来的，我觉得这个几率也太小了吧！
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3楼2013-07-26 15:39:43
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zhangbighui

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你与marker差了多少，因为marker也是粗略估算，如果差的不是很多没有关系。你可否把你的PAGE图贴上啊，这样好分析，目前听你的描述，我有疑问：之前有单一条带确定是目的蛋白吗？第二次跑会不会有蛋白保存不当的原因会造成蛋白降解。
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成功，就是成为你想成为的人
4楼2013-07-26 16:06:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by summer沙 at 2013-07-26 15:39:43
查了大概20KD左右，是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。之前出来过一次目的单条带，但是老师觉得是胶被拉长了，跑啊下来了，所以才会出来的，我觉得这个几率也太小了吧！...

你纯化的是重组蛋白？带什么标签吗？表达产物的理论分子量计算是否有误？
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5楼2013-07-26 22:34:08
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summer沙

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 22:34:08
你纯化的是重组蛋白？带什么标签吗？表达产物的理论分子量计算是否有误？...

恩恩，是重组蛋白，带的是组氨酸标签，理论分子量是查的文献，谷胱甘肽过氧化物酶24LD左右。
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6楼2013-07-27 15:26:05
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summer沙

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangbighui at 2013-07-26 16:06:37
你与marker差了多少，因为marker也是粗略估算，如果差的不是很多没有关系。你可否把你的PAGE图贴上啊，这样好分析，目前听你的描述，我有疑问：之前有单一条带确定是目的蛋白吗？第二次跑会不会有蛋白保存不当的原因 ...

就是这两个对比图，不太会弄，弄成附件上传了，点了mark的图，单挑带出现自第三条带出。而且跑纯化后的每一管几乎都有那个同一位置的条带。
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7楼2013-07-27 15:35:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by summer沙 at 2013-07-27 15:26:05
恩恩，是重组蛋白，带的是组氨酸标签，理论分子量是查的文献，谷胱甘肽过氧化物酶24LD左右。...

查文献？重组蛋白的理论分子量要根据自己的表达载体和克隆位置来算。
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8楼2013-07-27 23:03:40
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summer沙

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-27 23:03:40
查文献？重组蛋白的理论分子量要根据自己的表达载体和克隆位置来算。...

转化后的表达的蛋白不应该和这种酶原本的大小差不多吗？
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9楼2013-07-28 11:30:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by summer沙 at 2013-07-28 11:30:19
转化后的表达的蛋白不应该和这种酶原本的大小差不多吗？...

很多表达载体上带有不同的融合标签，有的标签不像his-tag那么小。所以要查看所用表达载体的种类和目的基因插入的位置。
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10楼2013-07-28 23:11:56
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