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summer沙

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白纯化

做蛋白纯化后跑电泳,出来过一次单条带,在和mark跑的时候居然没有目的大小的单条带,而是大分子量的单条带了。这很奇葩啊,不太想从头开始了,拜托各位大神指导指导啊!求原因,求分析啊!
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
分子量与理论值差多少?跑的是还原胶还是非还原胶?
2楼2013-07-26 01:07:16
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summer沙

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 01:07:16
分子量与理论值差多少?跑的是还原胶还是非还原胶?

查了大概20KD左右,是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。之前出来过一次目的单条带,但是老师觉得是胶被拉长了,跑啊下来了,所以才会出来的,我觉得这个几率也太小了吧!
3楼2013-07-26 15:39:43
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zhangbighui

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你与marker差了多少,因为marker也是粗略估算,如果差的不是很多没有关系。你可否把你的PAGE图贴上啊,这样好分析,目前听你的描述,我有疑问:之前有单一条带确定是目的蛋白吗?第二次跑会不会有蛋白保存不当的原因会造成蛋白降解。
成功,就是成为你想成为的人
4楼2013-07-26 16:06:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by summer沙 at 2013-07-26 15:39:43
查了大概20KD左右,是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。之前出来过一次目的单条带,但是老师觉得是胶被拉长了,跑啊下来了,所以才会出来的,我觉得这个几率也太小了吧!...

你纯化的是重组蛋白?带什么标签吗?表达产物的理论分子量计算是否有误?
5楼2013-07-26 22:34:08
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summer沙

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 22:34:08
你纯化的是重组蛋白?带什么标签吗?表达产物的理论分子量计算是否有误?...

恩恩,是重组蛋白,带的是组氨酸标签,理论分子量是查的文献,谷胱甘肽过氧化物酶24LD左右。
6楼2013-07-27 15:26:05
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summer沙

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangbighui at 2013-07-26 16:06:37
你与marker差了多少,因为marker也是粗略估算,如果差的不是很多没有关系。你可否把你的PAGE图贴上啊,这样好分析,目前听你的描述,我有疑问:之前有单一条带确定是目的蛋白吗?第二次跑会不会有蛋白保存不当的原因 ...

就是这两个对比图,不太会弄,弄成附件上传了,点了mark的图,单挑带出现自第三条带出。而且跑纯化后的每一管几乎都有那个同一位置的条带。

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  • 2013-07-27 15:30:56, 612.92 K
7楼2013-07-27 15:35:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by summer沙 at 2013-07-27 15:26:05
恩恩,是重组蛋白,带的是组氨酸标签,理论分子量是查的文献,谷胱甘肽过氧化物酶24LD左右。...

查文献?重组蛋白的理论分子量要根据自己的表达载体和克隆位置来算。
8楼2013-07-27 23:03:40
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summer沙

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-27 23:03:40
查文献?重组蛋白的理论分子量要根据自己的表达载体和克隆位置来算。...

转化后的表达的蛋白不应该和这种酶原本的大小差不多吗?
9楼2013-07-28 11:30:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by summer沙 at 2013-07-28 11:30:19
转化后的表达的蛋白不应该和这种酶原本的大小差不多吗?...

很多表达载体上带有不同的融合标签,有的标签不像his-tag那么小。所以要查看所用表达载体的种类和目的基因插入的位置。
10楼2013-07-28 23:11:56
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