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aust

金虫 (正式写手)

一只老虫

[求助] 质粒转化后鉴定的问题

我前几天扩增了一个目的基因，把它连接到克隆载体后，转化DH5α，铺板（LB+AMP）。挑取单克隆后摇菌，取2μl为模板进行PCR鉴定，结果为阳性，条带大小完全符合预期目标，然后送测序，并同时－70C保种。测序结果提示是空载，不含目的基因。我把保种菌液复苏后重新划线接种，单克隆一样长的很好，再次挑取后摇菌并PCR鉴定，结果却成阴性了。而且更奇怪的是我同时还把以前保种的菌液也复苏做了PCR鉴定，却也成阴性了。请问哪位高手能帮我解释一下，为何保种前能P出来，保种后复苏就P不出来了？
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1楼 2007-11-02 09:46:39
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aust

金虫 (正式写手)

一只老虫
我后来挑了30个单克隆菌落作的菌落PCR，但全为阴性。所有的反应体系及反应条件均未变。现在开始从头做了，谢谢！不知道有没有虫虫们也遇到过类似的情况？
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3楼2007-11-09 16:49:06
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随风而过

银虫 (小有名气)
★ ★
aust(金币+2,VIP+0):谢谢！
1.确定你的过程条件有没有改变.
2.多筛点阳性菌落看能不能找到
3.从结果看很有可能是在做PCR鉴定时受到污染结果出现“假阳性”如果可以，我建议重头做，每一步都要做验证就知道问题出在那了
不知道你做PCR的时候有没有做阳性对照？
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2楼2007-11-05 15:32:20
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hn_zht

铁虫 (著名写手)
★
aust(金币+1,VIP+0):谢谢你的回复
很遗憾的告诉你:
1.你的AMP浓度是否是100μlAMP 加入100ml的LB中?及AMP的浓度是否合适
2.你验证的时候挑选的刚好是阳性克隆,其他是阴性的但菌已经有AMP抗性
3.是否是你的蒸馏水污染了目的基因?缓冲夜呢
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欢迎加入糖生物技术群：177364074
4楼2007-11-09 20:08:18
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