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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求高手指点PCR
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lcy1971

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by lijianfu12 at 2013-07-22 10:46:48
pcr过程是：
94℃ 5min
94℃  1mim
55℃  1min
72℃  1min
72℃  7min
30个循环...

2k长度，一般延伸2分钟较好，1分钟可能不够。变性和退火30秒应该就可以了。
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21楼2013-07-22 17:52:05
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hyc_charles

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by lijianfu12 at 2013-07-22 11:14:25
不好意思，我菜鸟一个！
目的是做植物某个酶的基因克隆，大概念2000bp，
pcr体系：50µl
10 Ex Taq Buffer  5µl
引物各2µl
模版2µl
taq酶2µl
mgcl2  3& ...

你的PCR体系里怎么没有dNTPmix呢，是不是忘加了！！
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不但要做一个优秀的人，更要做一个无可取代的人…
22楼2013-07-22 18:26:29
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lijianfu12 at 2013-07-22 10:46:48
pcr过程是：
94℃ 5min
94℃  1mim
55℃  1min
72℃  1min
72℃  7min
30个循环...

模板和引物 浓度呢？
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23楼2013-07-22 19:24:38
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xz2001199802

金虫 (正式写手)
其他的原因先不说，延伸的时间就不够，2000bp，TAQ跑不出来的
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越学越无知
24楼2013-07-22 19:33:01
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dreamsnow2004

银虫 (初入文坛)
没有目的条带，那个200左右的是引物二聚体吧
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25楼2013-07-22 20:13:06
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yuer9809

至尊木虫 (著名写手)
引物有没有问题，别设计出来本来就P不到东西。 模板质量如何？解决这2个问题。PCR其实很好做。
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26楼2013-07-22 22:05:02
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Sthunder

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by lijianfu12 at 2013-07-22 10:50:37
我设计6对引物p的，只有两对引物p出200bp，其他没条带。。。...

你说的6对引物是针对你的目的基因？那你目的基因大小是多少？你P出来的条带和对应引物预计大小是否一致？
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互助互励，共奋共进！！
27楼2013-07-23 00:21:50
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lijianfu12

银虫 (正式写手)
引用回帖:
27楼: Originally posted by Sthunder at 2013-07-23 00:21:50
你说的6对引物是针对你的目的基因？那你目的基因大小是多少？你P出来的条带和对应引物预计大小是否一致？...

目的基因是2000左右的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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好好搞学术
28楼2013-07-23 08:18:03
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lijianfu12

银虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by yuer9809 at 2013-07-22 22:05:02
引物有没有问题，别设计出来本来就P不到东西。 模板质量如何？解决这2个问题。PCR其实很好做。

引物放NCBI能够出来！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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好好搞学术
29楼2013-07-23 08:19:01
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lijianfu12

银虫 (正式写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-07-22 19:24:38
模板和引物 浓度呢？...

模板和引物个2μL

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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好好搞学术
30楼2013-07-23 08:20:37
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