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lijianfu12

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11楼: Originally posted by zhangyi05 at 2013-07-22 10:59:23
我P 2000的片段一般延伸2分钟。

这是我用的引物：
F--GCAGGTACGTTTTTTCATACGCTG
R--CCTCCTCGAAAGCACCTATCTTTAAG

好好搞学术

12楼2013-07-22 11:02:28

hyc_charles

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你要说详细点，你的目的是什么，用的什么体系，多少浓度的胶

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不但要做一个优秀的人，更要做一个无可取代的人…

13楼2013-07-22 11:03:20

lijianfu12

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13楼: Originally posted by hyc_charles at 2013-07-22 11:03:20
你要说详细点，你的目的是什么，用的什么体系，多少浓度的胶

不好意思，我菜鸟一个！
目的是做植物某个酶的基因克隆，大概念2000bp，
pcr体系：50µl
10 Ex Taq Buffer  5µl
引物各2µl
模版2µl
taq酶2µl
mgcl2  3µl
ddH2O 30µl
pcr过程：
94℃ 5min
94 ℃ 1min
55 ℃ 1min
72 ℃    1min
72 ℃    7min
30个循环
1%的琼脂糖电泳

好好搞学术

14楼2013-07-22 11:14:25

wangqi1107

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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-22 19:04:34

很明显延伸时间不够啊 taq酶 1min衍生1000bp 你这肯定不够啊另外引物和模板是否匹配？这都有可能得不到目的带。

15楼2013-07-22 11:39:55

cicelyzh

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8楼: Originally posted by lijianfu12 at 2013-07-22 10:48:28
没有试过不同退火温度，用的是TAq酶，延伸时间1min，30个循环...

taq酶的延伸速度是1kb/min，如果目标条带2kb, 延伸时间应该用2分钟比较好。循环中的变性和退火时间没必要1min，可以省点时间。

16楼2013-07-22 11:41:13

lijianfu12

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15楼: Originally posted by wangqi1107 at 2013-07-22 11:39:55
很明显延伸时间不够啊 taq酶 1min衍生1000bp 你这肯定不够啊另外引物和模板是否匹配？这都有可能得不到目的带。

那我怎么可以确定引物和模版的问题呢？

好好搞学术

17楼2013-07-22 12:05:35

lijianfu12

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16楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-22 11:41:13
taq酶的延伸速度是1kb/min，如果目标条带2kb, 延伸时间应该用2分钟比较好。循环中的变性和退火时间没必要1min，可以省点时间。...

好的，我试试！谢谢。。。

好好搞学术

18楼2013-07-22 12:07:09

kay23jasmine

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6楼: Originally posted by lijianfu12 at 2013-07-22 10:46:48
pcr过程是：
94℃ 5min
94℃  1mim
55℃  1min
72℃  1min
72℃  7min
30个循环...

72度2分钟比较好，你的条带2000bp，普通酶的速率是1000bp/min

19楼2013-07-22 17:34:44

kay23jasmine

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14楼: Originally posted by lijianfu12 at 2013-07-22 11:14:25
不好意思，我菜鸟一个！
目的是做植物某个酶的基因克隆，大概念2000bp，
pcr体系：50µl
10 Ex Taq Buffer 5µl
引物各2µl
模版2µl
taq酶2µl
mgcl2 3& ...

酶加2微么？略多了吧？另外你的dNTP呢……

20楼2013-07-22 17:38:47