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zhangyi05

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
11楼2013-07-22 10:59:23
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lijianfu12

银虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhangyi05 at 2013-07-22 10:59:23
我P 2000的片段一般延伸2分钟。

这是我用的引物：
F--GCAGGTACGTTTTTTCATACGCTG
R--CCTCCTCGAAAGCACCTATCTTTAAG
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好好搞学术
12楼2013-07-22 11:02:28
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hyc_charles

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你要说详细点，你的目的是什么，用的什么体系，多少浓度的胶

[ 发自小木虫客户端 ]
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不但要做一个优秀的人，更要做一个无可取代的人…
13楼2013-07-22 11:03:20
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lijianfu12

银虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by hyc_charles at 2013-07-22 11:03:20
你要说详细点，你的目的是什么，用的什么体系，多少浓度的胶

不好意思，我菜鸟一个！
目的是做植物某个酶的基因克隆，大概念2000bp，
pcr体系：50µl
10 Ex Taq Buffer  5µl
引物各2µl
模版2µl
taq酶2µl
mgcl2  3µl
ddH2O 30µl
pcr过程：
94℃ 5min
94 ℃   1min
55 ℃    1min
72 ℃     1min
72 ℃      7min
30个循环
1%的琼脂糖电泳
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好好搞学术
14楼2013-07-22 11:14:25
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wangqi1107

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-22 19:04:34
很明显 延伸时间不够啊 taq酶 1min衍生1000bp  你这肯定不够啊 另外引物和模板是否匹配？这都有可能得不到目的带。
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15楼2013-07-22 11:39:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by lijianfu12 at 2013-07-22 10:48:28
没有试过不同退火温度，用的是TAq酶，延伸时间1min，30个循环...

taq酶的延伸速度是1kb/min，如果目标条带2kb, 延伸时间应该用2分钟比较好。循环中的变性和退火时间没必要1min，可以省点时间。
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16楼2013-07-22 11:41:13
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lijianfu12

银虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by wangqi1107 at 2013-07-22 11:39:55
很明显 延伸时间不够啊 taq酶 1min衍生1000bp  你这肯定不够啊 另外引物和模板是否匹配？这都有可能得不到目的带。

那我怎么可以确定引物和模版的问题呢？
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好好搞学术
17楼2013-07-22 12:05:35
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lijianfu12

银虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-22 11:41:13
taq酶的延伸速度是1kb/min，如果目标条带2kb, 延伸时间应该用2分钟比较好。循环中的变性和退火时间没必要1min，可以省点时间。...

好的，我试试！谢谢。。。
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好好搞学术
18楼2013-07-22 12:07:09
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kay23jasmine

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by lijianfu12 at 2013-07-22 10:46:48
pcr过程是：
94℃ 5min
94℃  1mim
55℃  1min
72℃  1min
72℃  7min
30个循环...

72度2分钟比较好，你的条带2000bp，普通酶的速率是1000bp/min
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19楼2013-07-22 17:34:44
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kay23jasmine

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by lijianfu12 at 2013-07-22 11:14:25
不好意思，我菜鸟一个！
目的是做植物某个酶的基因克隆，大概念2000bp，
pcr体系：50µl
10 Ex Taq Buffer  5µl
引物各2µl
模版2µl
taq酶2µl
mgcl2  3& ...

酶加2微么？略多了吧？另外你的dNTP呢……
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20楼2013-07-22 17:38:47
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