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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR扩增DNA序列无条带
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夏财神

新虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增DNA序列无条带

最近设计了几对引物分别扩增E. coli和P. aeruginosa的两个基因，但一直没有跑出条带，请高手们指点一下。

想要扩增的目的基因分别为1500 bp和1200 bp，在NCBI找到相应基因后，用MIT的Primer3设计了引物，Tm≈59，GC%在50~55%，引物长20 b。

PCR扩增条件：94°C 4 min；94°C 1 min；54°C 1 min；72°C 1 min；72°C 7 min。跑了27个循环。电泳之后没有条带。

考虑没有条带的原因可能是：模板、Taq酶、反应条件等，又做了下试验。
1、模板是基因组DNA，直接电泳后发现23 kb有明显条带，那应该模板没问题。
2、Taq酶是Takara的，前几天同学刚用过，按理说也没问题，而且我也重新做了实验，分别用Takara和Invitrogen的酶跑PCR，都没与条带。
3、引物可能设计的有问题，我用原来跑出过条带的16s引物做了对照，如果16s跑出来那肯定就是引物问题，但都没有条带就不好说了。但是这个条件16s也跑不出来了... 无法确诊
4、重新调整退火温度到56°C，同样无条带。

求诸位高手帮忙分析下，PCR失败的原因可能会什么啊？万分感谢！！
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王萌萌1992

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1楼 2013-07-19 19:42:27
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mayuxiao

新虫 (初入文坛)
我现在也是这个问题，怎么办
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41楼2014-05-06 18:01:28
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kapa1

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
夏财神(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-20 10:45:57
如果之前可以跑出来的16S也跑不出来了 可能是总DNA的问题吧 你可以再试一下其他之前可以做出来的基因 比如COI这种效果好的 要是也没有 我觉得是总DNA的问题
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

夏财神
2楼2013-07-19 19:52:38
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夏财神

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by kapa1 at 2013-07-19 19:52:38
如果之前可以跑出来的16S也跑不出来了 可能是总DNA的问题吧 你可以再试一下其他之前可以做出来的基因 比如COI这种效果好的 要是也没有 我觉得是总DNA的问题

我是用Omega的试剂盒提的，基因组直接跑电泳结果还行。我试试原来提出来确定能跑的DNA看看。
谢谢哈！
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3楼2013-07-19 19:59:40
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是忘加什么东西了, 或者水出了问题.
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4楼2013-07-19 20:40:00
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查看全部 47 个回答
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