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jonew木虫 (正式写手)
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[求助]
求大神支招
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| 刚刚入道，做克隆，内参可以P出来，但是目标产物就是P不出来！而且PCR完了以后什么也没有，（退火温度、引物、模板浓度也调了几次）。请问哪位大神说说看下一步该怎么做？明天试着做温度梯度PCR。 |
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 核酸生物学实验经验 |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
jonew: 金币+5 2013-07-18 17:37:30
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jonew: 金币+5 2013-07-18 17:37:30
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楼主的情况是不出现扩增条带，问题与解决如下： PCR反应的关键环节有:1模板核酸的制备，2引物的质量与特异性，3.酶的质量，4. Mg2+ 浓度，5.物理原因，6.靶序列变异。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究，本帖最后写出了调整顺序。 1.模板：(1)模板中含有杂蛋白质，(2)模板中含有Taq酶抑制剂，(3)模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，(4)在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。(5)模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。 2.酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 3.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：(1)选定一个好的引物合成单位。(2)引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。(3)引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。(4)引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 4.Mg2+ 浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20μL、30μL、50μL。或100μL，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μL 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 5.物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 6.靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 一般的调整顺序：若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。 然后调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度。再往后，重新提取DNA模板、换酶和改变反应体积。最后这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。 过去，我也回答过PCR无产物的问题，但是这次回答按照近日我更新以后的内容回答。 |
6楼2013-07-18 15:55:03
