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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » pcr实验
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doubleping

新虫 (小有名气)

[求助] pcr实验

我做土壤DNA的16S区间扩增，将提取的DNA稀释10倍做12个样只有三个有条带，稀释20倍做4个样都有条带，但是有两个样条带非常淡，这是怎么回事？我给怎么办？
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1楼 2013-07-15 22:27:12
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模板浓度太高也有可能P不出来的，你需要优化模板的稀释倍数。
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2楼2013-07-16 01:21:33
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枫叶丹

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以先测一下DNA浓度，再稀释到10至20纳克每微升，土壤里面有很多杂质，你再看一下260/280,260/230，DNA质量好的话就应该行，若不好，你可以先纯化一下再P
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3楼2013-07-16 08:45:11
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doubleping

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-16 01:21:33
模板浓度太高也有可能P不出来的，你需要优化模板的稀释倍数。

我当时提dna的时候琼脂糖检测不是很亮，应该不是模板浓度太高吧？提的dna是很深的黄色，是杂质太多了吧，这样怎么办呢？是纯化比较好吗

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4楼2013-07-16 10:02:37
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doubleping

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 枫叶丹 at 2013-07-16 08:45:11
你可以先测一下DNA浓度，再稀释到10至20纳克每微升，土壤里面有很多杂质，你再看一下260/280,260/230，DNA质量好的话就应该行，若不好，你可以先纯化一下再P

我们没有微量的比色皿，所以做检测会浪费很多样，我本来样就很少了，这样该怎么办

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5楼2013-07-16 10:06:32
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有时候模板稀释后能扩增更好往往是模板含有比较多抑制PCR的杂质。建议多提取一些，然后纯化好一点，比如用酚氯仿去蛋白，CTAB去蛋白去糖，用核酸沉淀剂沉淀，提高纯度和浓度，再做模板稀释梯度的PCR。
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为什么
6楼2013-07-16 10:21:26
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547star

木虫 (著名写手)
土壤来源的有腐殖质，一般要用PVP去除，搜索了一个方法，估计可以参考http://www.everlab.net/News/da6a ... 0-112e4b1b4f1d.html
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为什么
7楼2013-07-16 10:25:57
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by doubleping at 2013-07-16 10:02:37
我当时提dna的时候琼脂糖检测不是很亮，应该不是模板浓度太高吧？提的dna是很深的黄色，是杂质太多了吧，这样怎么办呢？是纯化比较好吗
...

PCR的模板用量很少，一般原核生物基因组为10ng，真核生物为100ng。你可以做nanodrop定量。不行的话跑胶参比marker后估算。样品不纯可以酚氯仿抽提去蛋白，再次乙醇沉淀。或者用column吸附.
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8楼2013-07-16 11:13:38
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zhang1zheng2

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做负对照了么。确定条带不是非特异性的？
如果是所要的带，
改进的话，一个是重新提基因组，尽量纯化。
一个是做个梯度，试模板用量和PCR条带的关系
你只给出两个条件，还不足以分析原因。
可以用稀释30、25、20、10、5倍数的基因组做模板，进行PCR，摸索规律
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手握日月摘星辰，看透生死破凡尘
9楼2013-07-16 22:29:15
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doubleping

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zhang1zheng2 at 2013-07-16 22:29:15
做负对照了么。确定条带不是非特异性的？
如果是所要的带，
改进的话，一个是重新提基因组，尽量纯化。
一个是做个梯度，试模板用量和PCR条带的关系
你只给出两个条件，还不足以分析原因。
可以用稀释30、25、 ...

什么是负对照，怎么知道是不是非特异性？我今天又做了稀释20和30倍都扩增24个样，结果稀释20倍扩增出12个，都很亮，30倍扩增出13个，只有几个很亮，其他都非常暗，这样正常吗，接下来我是继续优化稀释倍数，找出最亮的稀释倍数吗？

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10楼2013-07-16 23:35:00
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