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怀疑两个蛋白之间有非共价键结合力，如何解离？
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| 如题，我提取菌体的粗酶液，里面有一个为100多KD的大分子蛋白，一个为10KD左右的蛋白，我想提取的是小分子量10KD的蛋白，但是提取过程中，发现蛋白量极低，怀疑是不是和大分子蛋白之间和非共价键结合作用？对于这种非共价结合的作用力，该如何解离？由于是保证蛋白的活性，非常极端的解离剂如pH2.0的甘油解离剂就不好用，各位有什么好的建议或者文献，提供一下吧，谢谢 |
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 蛋白质生物学实验经验 | D-HBB |
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拆分蛋白质多聚体为单体的试验方法有哪些？ 答：拆分蛋白质多聚体为单体的试验方法可以参考亲和层析的试验方法：（1）改变pH值或离子强度：比如可以使用NaCl梯度拆解，主要是用于静电作用引起的相互作用的蛋白质多聚体，改变pH值可以跟缓冲溶液的组成加入相应的酸或者碱；（2）如果蛋白质多聚体主要为疏水相互作用，而且改变pH值的结果不够有效，则需要用激烈的条件，比如加入聚乙二醇（最多到到60%，要分梯度加入）或二甲基亚砜（dimethylsulfoxide）（一般最多到到10%，要分梯度加入）以降低水溶液的极性（3）可以考虑加入加入去垢剂(表面活性剂)，它们是具有亲水基又具有疏水基的物质，能够在低于临界胶束浓度（Citical Micelle Concentration ，简称：CMC）时有效结合于蛋白质的疏水区域，因此一般具有乳化、分散、和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂在蛋白提取 钟应用的较多。 一般考虑使用的是：中性去垢剂或生物表面活性剂。中性去垢剂 又称非离子表面活性剂，对蛋白质的变性作用影响较少，宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类，如PEG200；多元醇类表面活性剂，如 山梨醇、司 盘类和吐温类；聚氧乙烯脂肪醇醚，如苄泽类、平平加类；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如Igepal CO、乳化剂OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌。中性去垢剂作用后可通过Sephadex LH-50柱除去；也可直接上DEAE-Sephadex柱层析分离目的蛋白，不必先除去去垢剂。 也可以用天然表面活性剂 又称为生物表面活性剂，包括种类较为广泛，如各种树胶（阿拉伯胶、杏胶、桃胶、果胶）、明胶、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、琼脂、海藻酸钠、酪蛋白、胆甾醇、胆 酸类、多糖类（如环糊精）等。具体用法可以参考有关试剂使用说明。浓度尽量低一些为好，浓度不能超过临界胶束浓度（Citical Micelle Concentration ，简称：CMC）。 临界胶束浓度cmc的含义如下：在水中的表面活性剂低浓度时呈分子状态，并且三三两两地把亲油基团靠拢而分散在水中，当浓度逐渐增大一定程度时，许多表面活性剂分子立刻结合成大基团，形成“胶束”表面活性剂在水中形胶束所需的最低浓度称为临街胶束浓度，即CMC.意义：CMC可作为表面活性剂表面活性的一种度量，CMC越小，表明这种活性剂形成胶束所需的浓度越低，达到表面饱和吸附的浓度越低。因而改变表面性质从 而起到润湿，乳化，增溶，起泡等作用所需的浓度也越低。此外，临界胶束浓度也是表面活性剂溶液性质发生显著变化的一个分水岭，CMC值对表面活性剂的研究 有着及其重要的参考价值的数据。 临界胶束浓度测定方法很多，用不同方法验证即可（1）表面张力法http://www.anatrace.com/tech_tips/TechBul_105.pdf（2）电导率法 方法＆原理http://151.fosu.edu.cn/hxsy/wuli ... daofajiaosu%20z.htmhttp://u.edu.cn/UpLoadFile/20080119080151.doc （3）紫外吸收分光光谱http://www.ilib.cn/A-hxxb200624009.html（4）.芘荧光探针光谱法http://www.ilib.cn/A-shjsyyy200701012.html其中芘荧光探针光谱法可信度较高 （5）Citical Micelle Concentration by Conductance and Ramanhttp://ed.augie.edu/~awaspaas/pchem/labs/cmc/cmc.html（4）也可以采用高浓度的（到3mol/L）的离子解离盐（比如KCN或KI）或中低浓度的变性剂（低于4mol/L）的尿素或盐酸胍，都是分梯度加入。总之，只要能拆解开多聚体即可，尽量少或不要变性，拆解后可用层析方法或者离心方法分离开多聚体和单体，分离开的多聚体再如前法循环操作分离到单体。 二硫键的连接是共价连接，不属于非共价相互作用，如果真的出现可以用DTT和巯基乙醇还原，必要时要加入SDS以便疏松肽链，暴露出二硫键。 举个简单的拆分蛋白质多聚体的例子：研究核糖体的亚基的装配顺序，或者说研究核糖体的自组装过程。我想用基因突变各个组成核糖体亚基的办法是不现实的，而且我们很难预测如何突变才能使得突变后的亚基的某种组成蛋白质（如L12）不会装配到核糖体中去，如果完全敲除掉亚基的某种组成蛋白质（如L12），那木可能就必须要用非细胞翻译体系了，而且要把核糖体的亚基的各种组成蛋白质的基因依次完全敲除掉个遍，工作量甚大！再有即使采用非细胞翻译体系，也许必要保留相当部分的核糖体的亚基的基因必须是完整的（不然翻译本身就可能没有办法进行了），这样完整的组成蛋白质的基因的产物如何从我们要研究的至少缺失一种亚基的某种组成蛋白质（如L12）的自组装体系中加以去除，也是很大的问题。那怎么办？ 最简单的一种试验方法（用于研究核糖体的的各种组成成分-----各个蛋白质和rRNA的组装顺序，或者说核糖体的自组装过程）：把核糖体的的各种组成成分-----各个蛋白质和rRNA在细胞外解离开（方法如上所述），然后用分子筛层析分离出核糖体的的各种组成成分-----各个蛋白质和rRNA，而后将分离出的核糖体的的各种组成成分-----各个蛋白质和rRNA以不同的组合方式混合到一个容器中，观察其相互作用。 以前我回答过类似问题，但是这次回答加了内容，核糖体的自组装顺序的研究方法就是新加上的内容。 另外区别共价和非共价作用方法很多，比如用SDS-PAGE和MS都可以。 |
4楼2013-08-06 01:20:40
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