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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 醛缩酶溶解于PBS亚基会分开吗
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qwe0907123

木虫 (正式写手)

[交流] 醛缩酶溶解于PBS亚基会分开吗 已有1人参与

醛缩酶是由4条亚基组成的分子量为158000Da的分子。请问将它溶解于ph为7左右的PBS中它的亚基会分离吗？想用它做凝胶过滤的蛋白质分子量标准但担心亚基分离测得的是其亚基的分子量，因此请教此问题。谢谢！
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1楼 2013-06-26 10:53:39
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-26 14:25:45
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 太强大了 2013-06-27 16:08:17
楼主的担忧是多虑的，我们可以从两个角度证明pH大约为7时醛缩酶(aldolase)是4亚基聚合的。

1.从细胞内环境角度分析：
醛缩酶(aldolase)在动植物细胞中是糖酵解的组成酶，催化果糖-1，6-二磷酸转变为二羟丙酮磷酸和甘油醛-3-磷酸，及其逆反应。在动植物细胞中醛缩酶(aldolase)处于细胞质基质，环境基本上是中性的，pH大约为7，此时醛缩酶(aldolase)是4亚基聚合的。如果要让其的4个亚基解聚，需要有一些其他的调控因子。

2.从体外解离多亚基蛋白质的具体试验方法分析：
拆分蛋白质多聚体为单体或者多亚基蛋白质为单个亚基的试验方法有哪些？
答：拆分蛋白质多聚体为单体的试验方法可以参考亲和层析的试验方法：
（1）改变pH值或离子强度：比如可以使用NaCl梯度拆解，主要是用于静电作用引起的相互作用的蛋白质多聚体，改变pH值可以跟缓冲溶液的组成加入相应的酸或者碱；
（2）如果蛋白质多聚体主要为疏水相互作用，而且改变pH值的结果不够有效，则需要用激烈的条件，比如加入聚乙二醇（最多到到60%，要分梯度加入）或二甲基亚砜（dimethylsulfoxide）（一般最多到到10%，要分梯度加入）以降低水溶液的极性。
（3）可以考虑加入加入去垢剂(表面活性剂)，它们是具有亲水基又具有疏水基的物质，能够在低于临界胶束浓度（Citical Micelle Concentration ，简称：CMC）时有效结合于蛋白质的疏水区域，因此一般具有乳化、分散、和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂在蛋白提取 钟应用的较多。    一般考虑使用的是：中性去垢剂或生物表面活性剂。中性去垢剂 又称非离子表面活性剂，对蛋白质的变性作用影响较少，宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类，如PEG200；多元醇类表面活性剂，如 山梨醇、司 盘类和吐温类；聚氧乙烯脂肪醇醚，如苄泽类、平平加类；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如Igepal CO、乳化剂OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌。中性去垢剂作用后可通过Sephadex LH-50柱除去；也可直接上DEAE-Sephadex柱层析分离目的蛋白，不必先除去去垢剂。   也可以用天然表面活性剂 又称为生物表面活性剂，包括种类较为广泛，如各种树胶（阿拉伯胶、杏胶、桃胶、果胶）、明胶、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、琼脂、海藻酸钠、酪蛋白、胆甾醇、胆 酸类、多糖类（如环糊精）等。具体用法可以参考有关试剂使用说明。浓度尽量低一些为好，浓度不能超过临界胶束浓度（Citical Micelle Concentration ，简称：CMC）。  临界胶束浓度cmc的含义如下：在水中的表面活性剂低浓度时呈分子状态，并且三三两两地把亲油基团靠拢而分散在水中，当浓度逐渐增大一定程度时，许多表面活性剂分子立刻结合成大基团，形成“胶束”表面活性剂在水中形胶束所需的最低浓度称为临街胶束浓度，即CMC.意义：CMC可作为表面活性剂表面活性的一种度量，CMC越小，表明这种活性剂形成胶束所需的浓度越低，达到表面饱和吸附的浓度越低。因而改变表面性质从 而起到润湿，乳化，增溶，起泡等作用所需的浓度也越低。此外，临界胶束浓度也是表面活性剂溶液性质发生显著变化的一个分水岭，CMC值对表面活性剂的研究 有着及其重要的参考价值的数据。 
 临界胶束浓度测定方法很多，用不同方法验证即可
a.表面张力法：http://www.anatrace.com/tech_tips/TechBul_105.pdf
b.电导率法 方法＆原理http://151.fosu.edu.cn/hxsy/wuli ... daofajiaosu%20z.htmhttp://u.edu.cn/UpLoadFile/20080119080151.doc
c.紫外吸收分光光谱http://www.ilib.cn/A-hxxb200624009.html
d.芘荧光探针光谱法http://www.ilib.cn/A-shjsyyy200701012.html其中芘荧光探针光谱法可信度较高
e.Citical Micelle Concentration by Conductance and Ramanhttp://ed.augie.edu/~awaspaas/pchem/labs/cmc/cmc.html
（4）也可以采用高浓度的（到3mol/L）的离子解离盐（比如KCN或KI）或中低浓度的变性剂（低于4mol/L）的尿素或盐酸胍，都是分梯度加入。总之，只要能拆解开多聚体即可，尽量少或不要变性，拆解后可用层析方法或者离心方法分离开多聚体和单体，分离开的多聚体再如前法循环操作分离到单体。

楼主的体外实验条件还不足以拆分蛋白质多聚体为单体或者多亚基蛋白质为单个亚基。
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2楼2013-06-26 14:14:10
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qwe0907123

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-26 14:14:10
楼主的担忧是多虑的，我们可以从两个角度证明pH大约为7时醛缩酶(aldolase)是4亚基聚合的。

1.从细胞内环境角度分析：
醛缩酶(aldolase)在动植物细胞中是糖酵解的组成酶，催化果糖-1，6-二磷酸转变为二羟丙酮磷酸 ...

非常感谢！！！
那关于过氧化氢酶，也是4聚体。但用同样的PBS溶解测分子量时，测定的却是一个亚基的大小。请问这是怎么回事呢？（查阅文献后发现它亚基间是非共价键结合，每个亚基都有活性位点）
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3楼2013-06-26 17:00:41
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-27 11:33:43
引用回帖:
3楼: Originally posted by qwe0907123 at 2013-06-26 17:00:41
非常感谢！！！
那关于过氧化氢酶，也是4聚体。但用同样的PBS溶解测分子量时，测定的却是一个亚基的大小。请问这是怎么回事呢？（查阅文献后发现它亚基间是非共价键结合，每个亚基都有活性位点）...

过氧化氢酶的亚基在该pH和较低的离子强度之环境下发生构象变化了，所以接力了，过氧化氢酶在生理条件下是在过氧化酶体的封闭区间里，所以稳定性不适用于细胞质环境。任何的亚基彼此缔合都是非共价键的，没有共价键的结合的不同的亚基。亚基之间的结合最重要来自疏水相互作用。要想让过氧化氢酶保持4亚基聚合体，可以适当增加溶液离子强度，比如加入中性盐，另外查一下你测定的过氧化酶来源的细胞的过氧化酶体内的大致的pH值把缓冲溶液调到那个pH值附近即可保持让过氧化氢酶保持4亚基聚合体（可以同时适当加大溶液离子强度）。
多亚基的蛋白质的每个亚基都有活性位点并不奇怪！比如PKA的两个C亚基每一个上都有活性位点，G蛋白质的三个亚基不同，但是每个亚基各有不同的活性。
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4楼2013-06-26 22:30:13
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qwe0907123

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-26 22:30:13
过氧化氢酶的亚基在该pH和较低的离子强度之环境下发生构象变化了，所以接力了，过氧化氢酶在生理条件下是在过氧化酶体的封闭区间里，所以稳定性不适用于细胞质环境。任何的亚基彼此缔合都是非共价键的，没有共价键 ...

哦，多谢指导！
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5楼2013-06-27 09:56:39
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