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zmclk

银虫 (小有名气)

[求助] 一篇基因克隆的文章,审稿人提出这样的问题,请求大牛指点回答

Without the availability of a genome, the authors cannot guarantee that the primers are gene-specific. They might amplify isoforms, close duplicates or SNP isoforms that cannot be distinguished by general qPCR.
我克隆出序列全长后,设计引物做Real-time PCR,审稿人说我的引物不是特异性的,我该怎么回答呢?

[ Last edited by zmclk on 2013-6-5 at 09:41 ]
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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zmclk(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-06-05 11:34:36
审稿人问的是你调取基因的时候使用的是PCR扩增的方法,是在你已知基因的序列设计的。那么审稿人的顾虑或疑问是如果是一个全新的基因,没有可用的同源基因,那么这个方法还能就不那么通用了!所以你需要回答的是告诉审稿人你的方法是否具有一般性,还是就回答你的方法就是用来在已有一定序列信息的前提下使用的。
所以一般文章结尾不要说太泛泛的言语。
2楼2013-06-05 10:33:07
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zmclk

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by stevenshi021 at 2013-06-05 10:33:07
审稿人问的是你调取基因的时候使用的是PCR扩增的方法,是在你已知基因的序列设计的。那么审稿人的顾虑或疑问是如果是一个全新的基因,没有可用的同源基因,那么这个方法还能就不那么通用了!所以你需要回答的是告诉 ...

我是在获得全长的基因序列基础上,设计的特异性引物,进行Real-time PCR,为什么就不能保证specificity呢?
3楼2013-06-05 11:27:15
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖


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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-08 12:06:18
引用回帖:
3楼: Originally posted by zmclk at 2013-06-05 11:27:15
我是在获得全长的基因序列基础上,设计的特异性引物,进行Real-time PCR,为什么就不能保证specificity呢?...

审稿人的意思是,你全基因组序列未知,然后你克隆出了该基因,你基于该基因序列设计引物做realtime PCR,你怎么保证该基因在该基因组中没有近似的duplicate,因为如果基因组序列已知的话,做个简单的比对就可以
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-06-05 11:37:32
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


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zmclk(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-06-09 02:51:50
可以考虑用SOUTHERN BLOT 鉴定一下拷贝数嘛,如果是单拷贝那就可以DEFENCE你的结果了
5楼2013-06-05 12:22:21
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zmclk(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-06-09 02:51:40
基因组未知,无法确定引物是特异的,当进行定量PCR的时候,不能区分isoforms, close duplicates or SNP isoforms 。这样一来,从你的定量PCR结果无法推出可靠的结论。你要证明做定量PCR的引物是特异的,能区分SNP亚型;引物也不会扩增 close duplicates 。
为什么
6楼2013-06-05 12:35:38
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zmclk

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 547star at 2013-06-05 12:35:38
基因组未知,无法确定引物是特异的,当进行定量PCR的时候,不能区分isoforms, close duplicates or SNP isoforms 。这样一来,从你的定量PCR结果无法推出可靠的结论。你要证明做定量PCR的引物是特异的,能区分SNP亚 ...

那如何证明定量PCR的引物是特异的呢??
7楼2013-06-05 16:23:23
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ivxy

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


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zmclk(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-06-09 02:52:00
将定量PCR产物送出测序,若序列完全和你的基因序列一样,就能说明是特异扩增
8楼2013-06-08 08:50:41
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