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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 一篇基因克隆的文章，审稿人提出这样的问题，请求大牛指点回答
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zmclk

银虫 (小有名气)

[求助] 一篇基因克隆的文章，审稿人提出这样的问题，请求大牛指点回答

Without the availability of a genome, the authors cannot guarantee that the primers are gene-specific. They might amplify isoforms, close duplicates or SNP isoforms that cannot be distinguished by general qPCR.
我克隆出序列全长后，设计引物做Real-time PCR，审稿人说我的引物不是特异性的，我该怎么回答呢？

[ Last edited by zmclk on 2013-6-5 at 09:41 ]
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1楼 2013-06-05 09:40:05
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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zmclk(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-06-05 11:34:36
审稿人问的是你调取基因的时候使用的是PCR扩增的方法，是在你已知基因的序列设计的。那么审稿人的顾虑或疑问是如果是一个全新的基因，没有可用的同源基因，那么这个方法还能就不那么通用了！所以你需要回答的是告诉审稿人你的方法是否具有一般性，还是就回答你的方法就是用来在已有一定序列信息的前提下使用的。
所以一般文章结尾不要说太泛泛的言语。
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2楼2013-06-05 10:33:07
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zmclk

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stevenshi021 at 2013-06-05 10:33:07
审稿人问的是你调取基因的时候使用的是PCR扩增的方法，是在你已知基因的序列设计的。那么审稿人的顾虑或疑问是如果是一个全新的基因，没有可用的同源基因，那么这个方法还能就不那么通用了！所以你需要回答的是告诉 ...

我是在获得全长的基因序列基础上，设计的特异性引物，进行Real-time PCR，为什么就不能保证specificity呢？
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3楼2013-06-05 11:27:15
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-08 12:06:18
引用回帖:
3楼: Originally posted by zmclk at 2013-06-05 11:27:15
我是在获得全长的基因序列基础上，设计的特异性引物，进行Real-time PCR，为什么就不能保证specificity呢？...

审稿人的意思是，你全基因组序列未知，然后你克隆出了该基因，你基于该基因序列设计引物做realtime PCR，你怎么保证该基因在该基因组中没有近似的duplicate，因为如果基因组序列已知的话，做个简单的比对就可以
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-06-05 11:37:32
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
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zmclk(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-09 02:51:50
可以考虑用SOUTHERN BLOT 鉴定一下拷贝数嘛，如果是单拷贝那就可以DEFENCE你的结果了
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5楼2013-06-05 12:22:21
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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zmclk(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-06-09 02:51:40
基因组未知，无法确定引物是特异的，当进行定量PCR的时候，不能区分isoforms, close duplicates or SNP isoforms 。这样一来，从你的定量PCR结果无法推出可靠的结论。你要证明做定量PCR的引物是特异的，能区分SNP亚型；引物也不会扩增 close duplicates 。
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为什么
6楼2013-06-05 12:35:38
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zmclk

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 547star at 2013-06-05 12:35:38
基因组未知，无法确定引物是特异的，当进行定量PCR的时候，不能区分isoforms, close duplicates or SNP isoforms 。这样一来，从你的定量PCR结果无法推出可靠的结论。你要证明做定量PCR的引物是特异的，能区分SNP亚 ...

那如何证明定量PCR的引物是特异的呢？？
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7楼2013-06-05 16:23:23
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ivxy

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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zmclk(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-09 02:52:00
将定量PCR产物送出测序，若序列完全和你的基因序列一样，就能说明是特异扩增
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8楼2013-06-08 08:50:41
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