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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » RT-PCR中的反转录cDNA的内参怎么做呢？
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houyuanming

金虫 (初入文坛)

[交流] RT-PCR中的反转录cDNA的内参怎么做呢？

我在做反转录cDNA的时候将cdna测量浓度是1000ng/ul，琼脂糖凝胶检测有弥散条带，我使用的是promaga的试剂盒，是否这样也可能没有反转录成功，内参怎么做呢，请指教详细一些，还有我将cdna进行pcr扩增就是不出条带，已经试验了快2个月了，退火温度也在梯度试验，不过无论改进什么都是不出条带，什么都没有，一般来说RT-PCR这一步骤出条带不应该是难点的呀 ？请各位高手指教
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1楼 2007-10-13 10:47:55
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复
逆转录完的cDNA跑琼脂糖其实很难看清的
我建议，最好用文献上的内参引物和条件试一下，把循环数提高再降低退火温度
JBC一类的杂志都会列出内参的引物序列和PCR条件的
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3楼2008-09-01 20:35:29
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llaall_123

顶，我也是啊，不出条带。RNA提取时，没有降解。都不知道是不是反转录出了问题，可是又不知道怎么鉴定反转录是否成功。
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2楼2008-09-01 20:28:54
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赵敏9565

铁虫 (小有名气)
★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复
你要考虑你的内参引物是否有问题？PCR条件是否有问题等！
再加一个阳性对照，比如其他人使用没问题的cDNA或者基因组DNA！
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4楼2008-09-01 21:18:14
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shs304

金虫 (正式写手)
可能是引物不对吧
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5楼2008-09-02 09:10:39
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