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harbingeryg金虫 (小有名气)
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[求助]
关于用OPC柱纯化长链脂酰辅酶A的操作，以及高胰岛素-正葡萄糖钳夹问题
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文献：Mechanism by Which Fatty Acids Inhibit Insulin Activation of Insulin Receptor Substrate-1 (IRS-1)-associated Phosphatidylinositol 3-Kinase Activity in Muscle 描述如下：LCACoAs were extracted from frozen tissue samples (100 mg) and purified using a solid phase extraction method described previously by Deutsch et al. (15) with minor modifications for desalting. A known amount of heptadecanoyl-CoA was added as an internal standard. OPC columns (Applied Biosystems, Foster City, CA) were used for solid phase extraction. Samples were dissolved in 100 l of methanol/H2O for LC/MS/MS analysis. 查了参考文献，翻译出来是这样的： 100mg 组织样品置于2 mL 100mM 磷酸二氢钾溶液中（PH=4.9），匀浆20 s，加入2 mL异丙醇，继续匀浆20 s，加入0.25 mL 饱和硫酸铵，4 mL 乙腈，涡旋5min，5min 1900g 离心，取上清，用10 mL 100mM 磷酸二氢钾溶液（PH=4.9）稀释。 Applied Biosystem Oligonucleotide purification cartridge (OPC). 乙腈5 mL冲洗，轻微过空气，25mM 磷酸二氢钾 5 mL，轻微过空气。聚丙烯注射针注入样品约15 mL， 25mM 磷酸二氢钾 5 mL 冲洗，抽干，两次。60%乙腈-100mM磷酸二氢钾0.3 mL,缓慢洗脱。后0.25mL为目标洗脱物。十七酰辅酶A作为内标。 脱盐处理。样品溶于100 uL 甲醇/水。 本人药物分析专业，只用过ODS固相小柱，没用过OPC柱，据说是纯化核酸的。 想请教的问题是： 1. OPC柱似乎也有类似的“活化”过程，但是为什么要轻微通过空气？ODS柱是要避免过空气抽干的。 2. 参考文献中由于是一般的液相方法，现在要进质谱所以要脱盐。文献中的minor modifications for desalting, 这个脱盐是要怎么弄？具体是在原方法基础上增加或者修改了什么步骤？求做过核酸和脂质纯化的前辈解答。 3. 额外问题一个，高胰岛素-正葡萄糖钳夹操作中，如何控制葡萄糖输入量，以维持血糖在正常范围？ |
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