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hugang2004_2000木虫 (正式写手)
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大质粒转化中有什么提高转化率的方法吗？急！！！
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请教大家，比较大的酶连产物（12kb）在转化到大肠杆菌中的时候有什么提高转化效率的方法吗？我们做的感受态大肠杆菌就是用分子克隆中的CaCl2方法，转化的大体步骤如下： 1. 酶连产物加入到200ul感受态细胞悬液中，flicking slightly 2. 冰上30分钟 3. 42度热激90秒 4. 冰上5分钟immediately 5. 超净台中加入1ml LB 6. 37度静置1h 7. 5000rpm, RT, 5min 8. 倾出大部分上清液，剩余大约200ul 9. plating 10. 37度倒置培养12-16小时 11. 挑取克隆 但是转化后总是没有克隆，用这种方法做的时候，其他比较小的酶连产物（<9kb）的转化结果都挺成功的，因此就觉得症结所在就是酶连产物太大，还没有找到合适的解决方法，拖了挺长时间了，请大家多多帮忙！！谢谢！！ |
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2楼2007-10-02 21:05:12
hugang2004_2000
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3楼2007-10-03 01:03:02
4楼2007-10-03 11:07:04
hugang2004_2000
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谢谢！ 值得高兴的是今天终于转化出来了，菌液 PCR的结果也是对的，真是高兴坏了！哈哈！ 只是，以后光这么重复也不是办法啊！下次试试上面的方法。具体的方法我先查一下吧，或者johnsooh那里有具体的实验方法？能否共享？多谢！ 我的信箱是：hugang2004_2000@yahoo.com.cn 十分感谢大家，祝大家节日快乐！ |
5楼2007-10-03 15:44:16
6楼2007-10-03 15:52:57
gandalf886
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7楼2007-10-03 17:38:19
hugang2004_2000
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8楼2007-10-03 19:06:14
guohuayin
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johnsooh(金币+2,VIP+0):辛苦了,国庆快乐
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做电转化也不是很难的，不要过分担心了，我给你个我用的很好的方法： 1. 取10ul菌液加入含有10ml SOB液体培养基的50ml三角瓶中，37℃，220rpm，过夜培养。 2. 第二天，以1：100的比例将培养的菌液加入100mlSOB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD600，当OD600值达到0.5-0.6时，停止培养。 3. 将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液转移入预冷的离心管中，4℃，2500rpm离心10分钟。 4. 弃上清，向离心管中加入100ml灭菌的双蒸水（4℃保存），重新悬浮菌体，然后4℃，4000rpm离心10分钟。 5. 弃上清，加入50ml灭菌的双蒸水（4℃保存），重新悬浮菌体，然后4℃，4000rpm，离心10min。 6. 弃上清，往离心管中加入50ml灭菌的10%甘油 (4℃保存)，重悬菌体，4000rpm， 离心10min。 7. 再加入50ml灭菌的10%甘油（4℃保存），重新悬浮菌体，然后4℃， 4000rpm， 离心10min。 8. 弃上清，每个离心管中加入1ml10％的甘油（4℃保存），使沉淀悬浮后，将菌液以80ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。 |
9楼2007-10-05 08:13:42
hugang2004_2000
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10楼2007-10-05 08:24:56